כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע
Summary
כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.
Abstract
Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא טכניקה נפוץ עבור מיפוי הלוקליזציה של שינויים היסטוניים post-translationally שונה, גרסאות היסטון, גורמי שעתוק או שינוי כרומטין אנזימים של לוקוס נתון או בקנה מידה הגנום כולו. השילוב של מבחני שבב עם הדור הבא רצפי (קרי, צ’יפ-Seq) היא גישה רב-עוצמה לחשוף באופן גלובלי רשתות בקרה רגולטריות וכדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום, במיוחד של רצפי תקינה ללא קידוד. שבב פרוטוקולים מחייבים בדרך כלל כמויות גדולות של חומר הסלולר, ובכך מסלק את הישימות של שיטה זו לחקירת סוגי תאים נדיר או ביופסיות רקמות קטנה. על מנת להפוך וזמינותו שבב תואם כמות חומר ביולוגי אשר בדרך כלל ניתן להשיג ויוו במהלך המוקדמות מופרה חוליות, נתאר כאן פרוטוקול שבב פשוטה שבה מספר השלבים הדרושים להשלמת assay הצטמצם כדי למזער את אובדן הדגימה. פרוטוקול שבב זה שימש בהצלחה לחקור שינוי היסטון שונים שונים עוף עובריים ורקמות העכבר למבוגרים באמצעות נמוך עד בינוני תא מספרים (5 x 104 – 5 x 105 תאים). חשוב, פרוטוקול זה תואם טכנולוגיית שבב-seq בשיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך לספק epigenomic גלובל מפות ברקמות עובריים מאוד רלוונטי.
Introduction
שינויים post-translational היסטון מעורבים ישירות תהליכים תלויי-כרומטין שונים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2,3. יתר על כן, שינויים שונים היסטון להראות חיובי (למשל, H3K4me3 ו- H3K27ac) או שלילי (למשל, H3K9me3 ו- H3K27me3) מתאמים עם ביטוי גנים, יכול להיות מוגדר באופן רחב כמו הפעלת או מדכאת היסטון מסמן, בהתאמה2,3. כתוצאה מכך, מפות שינוי היסטון גלובלית, המכונה גם epigenomic מפות, הופיעו כלי אוניברסלי ועוצמתי להוסיף ביאור פונקציונלית הגנום חוליות4,5. לדוגמה, דיסטלי רצפים רגולטוריות כגון משפרי ניתן לזהות המבוסס על הנוכחות של חתימות כרומטין ספציפיים (למשל, פעיל משפרי: H3K4me1 ו- H3K27ac), אשר להבדיל ביניהם לבין יזם proximal אזורים (למשל, היזמים פעיל: H3K4me3)6,7,8. מצד שני, גנים עם פונקציות הרגולציה של זהות תא העיקריים נמצאים בדרך כלל עם כרומטין רחבה תחומים מסומנים H3K4me3 או H3K27me3, בהתאם למצב פעיל או לא פעיל transcriptionally של גנים הבסיסית, בהתאמה9 ,10. באופן דומה, הביטוי של גנים זהות תא מרכזי נראה להיות לעתים קרובות תחת פיקוח מרובים והמרגשים מקובצים באשכולות משפרי (קרי, סופר משפרי), אשר יכול להיות מזוהה תחומים רחבה המסומן H3K27ac11.
כיום, מפות שינוי היסטון נוצרות באמצעות טכנולוגיית שבב-seq, אשר לעומת גישות קודמות כגון צ’יפס-שבב (צ’יפ מצמידים מיקרו-מערכים) מספק רזולוציה גבוהה יותר, חפצים פחות, פחות רעש, כיסוי גדול ואת התחתון עולה12. ובכל זאת, הדור של מפות epigenomic באמצעות טכנולוגיית שבב-seq יש מגבלות הטבועות, הקשורים בעיקר היכולת לבצע בהצלחה שבב הדגימות עניין. פרוטוקולים שבב מסורתי נדרש בדרך כלל מיליוני תאים, אשר מגבלת תחולתה של שיטה זו חוץ גופית בתוך תא קווים או תאים אשר ניתן בקלות מבודד ויוו (למשל, תאי דם). השנים האחרונות, מספר פרוטוקולים שבב ששונה תואם עם מספרי הטלפון הנייד נמוך כבר מתואר13,14,15,16. עם זאת, פרוטוקולים אלה נועדו במיוחד כדי להיות יחד עם הדור הבא רצפי (קרי, צ’יפ-seq), הם בדרך כלל להשתמש אד הוק ספריית הכנה שיטות13,14, 15 , 16.
כאן, אנו המתואר פרוטוקול הצ’יפ שיכול לשמש כדי לחקור שינוי היסטון פרופילים באמצעות מספרי הטלפון הנייד נמוכים בינוניים (5 x 104 – 5 x 105 תאים) או לוקוסים שנבחר (קרי, שבב-qPCR) או באופן גלובלי (קרי, שבב-seq) (איור 1). כאשר משולב שבב-seq לטכנולוגיה, פרוטוקול השבב שלנו יכול לשמש יחד עם שיטות הכנה ספרייה תקנית, ובכך בהרחבה נגיש מעבדות רבות10. פרוטוקול זה שימש לחקור מספר סימני היסטון (למשל, H3K4me3, H3K27me3 ו H3K27ac) ברקמות עוף שונה עובריים (למשל, בעמוד השדרה שפופרת פגמים בתעלה (SNT), frontonasal prominences ו epiblast). עם זאת, אנו צופים כי זה צריך להיות בהרחבה החלים על אורגניזמים אחרים שבו דגימות רלוונטי מבחינה ביולוגית או קלינית יכולה להיות מושגת רק בסכומים נמוכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenomic פרופיל של שינוי היסטון באמצעות שבב-seq יכול לשמש כדי לשפר את הביאור פונקציונלי של הגנום חוליות שונות בהקשרים הסלולר4,5,18. פרופילים אלה epigenomic יכול לשמש, בין היתר, כדי לזהות רכיבים משפר, להגדרת המדינה הרגולציה של מוצרי טיפוח טבעיים (קר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה Jan אפל לסיוע טכני מעולה שלו במהלך הקמתה של פרוטוקול זה. לעבודה במעבדה ראדה-איגלסיאס נתמך על-ידי CMMC מגזר מימון, מענקי מחקר DFG (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1, ו טה 1007/3-1), UoC מתקדמים החוקרת קבוצת גרנט, המענק CECAD.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
