الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة
Summary
هنا، نحن وصف إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) ورقاقة seq المكتبة إعداد بروتوكول لإنشاء التشكيلات الجانبية ابيجينوميك العالمية من عينات الدجاج منخفض-وفرة الجنينية.
Abstract
إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) تقنية تستخدم على نطاق واسع لرسم خرائط التعريب histones بوستترانسلاتيونالي المعدلة أو المتغيرات هستون، عوامل النسخ أو تعديل الكروماتين الإنزيمات في موضع معين، أو على نطاق الجينوم. مزيج فحوصات رقاقة مع الجيل التالي التسلسل (أي رقاقة Seq) نهج قوية لكشف الشبكات التنظيمية الجينات على الصعيد العالمي وتحسين الشروح الوظيفية من الجينوم، لا سيما من تسلسل تنظيمي غير الترميز. عادة ما تتطلب البروتوكولات رقاقة كميات كبيرة من المواد الخلوية، مما حال دون إمكانية تطبيق هذا الأسلوب للتحري عن أنواع نادرة من الخلية أو خزعات الأنسجة الصغيرة. من أجل جعل المقايسة رقاقة متوافقة مع كمية المواد البيولوجية التي يمكن الحصول عليها عادة في فيفو خلال أوائل embryogenesis الفقاريات، يصف لنا هنا بروتوكولا رقاقة مبسطة التي عدد الخطوات اللازمة لإكمال تم تخفيض مقايسة للتقليل من فقدان عينة. هذا البروتوكول رقاقة قد استخدمت بنجاح للتحقيق التعديلات هيستون مختلفة في مختلف الدجاج الجنينية والأنسجة الماوس الكبار استخدام منخفضة إلى أرقام الخلية المتوسطة (5 × 104 -5 × 105 الخلايا). الأهم من ذلك، هذا البروتوكول متوافقاً مع تكنولوجيا رقاقة seq استخدام أساليب إعداد المكتبة القياسية، وبالتالي توفير ابيجينوميك العالمية خرائط في الأنسجة الجنينية جداً ذات الصلة.
Introduction
هيستون بوستترانسلاشونال التعديلات بصورة مباشرة في العمليات المعتمدة على الكروماتين المختلفة، بما في ذلك النسخ والنسخ المتماثل والحمض النووي إصلاح1،،من23. وعلاوة على ذلك، تظهر التعديلات المختلفة هستون إيجابية (مثلاً، H3K4me3 و H3K27ac) أو السلبية (مثلاً، H3K9me3 و H3K27me3) العلاقات المتبادلة مع التعبير الجيني ويمكن تعريفها بشكل عام تحتفل هيستون تفعيل أو القمعية، على التوالي من2،،3. ونتيجة لذلك، ظهرت خرائط التعديل هيستون العالمية، كما يشار إلى خرائط ابيجينوميك، كأدوات قوية وعالمية تعليم وظيفيا جينومات الفقارية4،5. على سبيل المثال، تسلسل تنظيمي القاصي مثل كما يمكن تحديد القدرة على استناداً إلى وجود التواقيع الكروماتين محددة (مثلاً، نشط معززات: H3K4me1 و H3K27ac)، التي تميزها عن مناطق المروج الدانية (مثلاً، المروجين نشطة: H3K4me3)6،،من78. من ناحية أخرى، توجد الجينات مع المهام التنظيمية هوية الخلية الرئيسية عادة مع مجالات واسعة الكروماتين ملحوظ مع H3K4me3 أو H3K27me3، استناداً إلى حالة نشطة أو غير نشطة ترانسكريبتيونالي الجينات الكامنة على التوالي9 ،10. وبالمثل، يبدو التعبير عن الجينات هوية الخلية الرئيسية بشكل متكرر التحكم متعددة ومكانيا متفاوت القدرة على (أي، فائقة القدرة على)، التي يمكن تحديدها كمجالات واسعة بعلامات H3K27ac11.
حاليا، يتم إنشاؤها هستون تعديل خرائط استخدام seq رقاقة التكنولوجيا، والتي توفر الدقة العالية، القطع الأثرية أقل وأقل ضوضاء وتغطية أكبر وأقل بالمقارنة مع النهج السابقة مثل رقاقة رقاقة (شريحة بالإضافة إلى [ميكروارس]) تكاليف12. ومع ذلك، قد توليد خرائط ابيجينوميك باستخدام تكنولوجيا رقاقة seq قصورها المتأصلة، معظمها المرتبطة بالقدرة على القيام بنجاح برقاقة في عينات الفائدة. التقليدية رقاقة البروتوكولات المطلوبة عادة ملايين خلايا، التي حد خطوط انطباق هذا الأسلوب إلى المختبر في الخلية أو الخلايا التي يمكن بسهولة معزولة في فيفو (مثل خلايا الدم). في السنوات القليلة الماضية، عددا من البروتوكولات رقاقة معدلة متوافقة مع أرقام الخلية منخفض قد وصف13،14،،من1516. بيد أن هذه البروتوكولات مصممة خصيصا أن يقترن ذلك بتسلسل الجيل المقبل (أي رقاقة seq) وهم عادة استخدام المخصص المكتبة إعداد أساليب13،14، 15 , 16.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول رقاقة التي يمكن استخدامها للتحقيق هستون تعديل التشكيلات الجانبية باستخدام أرقام الخلية منخفضة إلى متوسطة (5 × 104 -5 × 105 خلايا) أما المكاني المحدد (أي رقاقة qPCR) أو على الصعيد العالمي (أي، رقاقة seq) (الشكل 1). عندما يقترن بتكنولوجيا رقاقة seq، يمكن استخدام بروتوكول رقاقة لدينا جنبا إلى جنب مع أساليب إعداد المكتبة القياسية، مما يجعلها متاحة على نطاق واسع للعديد من المختبرات10. تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في عدة علامات هيستون (مثلاً، H3K4me3 و H3K27me3 و H3K27ac) في الأنسجة الجنينية الدجاج مختلفة (مثلاً، العمود الفقري الأنبوب العصبي (SNT) وبرومينينسيس فرونتوناسال و epiblast). ومع ذلك، ونحن نتوقع أن يكون نطاق واسع ينطبق على غيرها من الكائنات الحية فيها عينات ذات صلة من الناحية البيولوجية و/أو سريرياً يمكن فقط الحصول على كميات منخفضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ابيجينوميك التنميط هستون تعديل استخدام seq رقاقة يمكن استخدامها لتحسين الشروح الوظيفية من جينومات الفقاريات في مختلف السياقات الخلوية4،5،18. يمكن استخدام هذه التشكيلات ابيجينوميك، من بين أمور أخرى، لتحديد العناصر محسن، تعريف الدولة التن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون يان أبيل لمساعدته التقنية ممتازة أثناء وضع هذا البروتوكول. العمل في مختبر رادا-إغليسياس معتمد من قبل كممك داخلية التمويل، منح البحوث DFG (RA 2547/1-1، RA 2547/2-1، و “الشركة المصرية للاتصالات” 1007/3-1)، باحث متقدم. جامعة ابرطا المجموعة منحة، والمنحة سيكاد.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
