Summary

Protocollo di immunoprecipitazione (ChIP) della cromatina per campioni embrionali bassa-abbondanza

Published: August 29, 2017
doi:

Summary

Qui, descriviamo un’immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e il protocollo di preparazione libreria ChIP-seq per generare profili epigenomic globale da campioni di embrionali di pollo di basso-abbondanza.

Abstract

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica ampiamente utilizzata per il mapping la localizzazione di istoni traduzionalmente modificati, varianti dell’istone, fattori di trascrizione o enzimi modificanti la cromatina a un dato locus o su una scala di genoma. La combinazione di analisi di ChIP con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-Seq) è un approccio potente per scoprire globalmente reti di regolazione genica e migliorare l’annotazione funzionale di genomi, soprattutto di non-codificazione di sequenze regolatrici. Protocolli di chIP normalmente richiedono grandi quantità di materiale cellulare, così precludendo l’applicabilità di questo metodo a investigare di tipi di cellule rare o le biopsie del tessuto piccolo. Al fine di rendere l’analisi del ChIP compatibile con la quantità di materiale biologico che in genere possa essere ottenuto in vivo durante l’embriogenesi dei vertebrati precoce, descriviamo qui un protocollo semplificato di ChIP in cui il numero di passaggi necessari per completare la analisi sono state ridotte per minimizzare la perdita di campione. Questo protocollo di ChIP è stato usato con successo per studiare le modificazioni istoniche differenti in vari pollo embrionale e tessuti di topo adulto utilizzando bassa ai numeri delle cellule medie (5 x 104 – 5 x 105 cellule). D’importanza, questo protocollo è compatibile con la tecnologia ChIP-seq utilizzando metodi di preparazione di libreria standard, fornendo così globale epigenomic mappe in tessuti embrionali altamente pertinenti.

Introduction

Modificazioni post-traduzionali degli istoni sono direttamente coinvolti nei vari processi di cromatina-dipendenti, compreso trascrizione, replicazione e DNA riparazione1,2,3. Inoltre, modificazioni istoniche differenti mostrano positivi (ad es., H3K4me3 e H3K27ac) o negativo (ad es., H3K9me3 e H3K27me3) correlazioni con espressione genica e possono essere definiti largamente come attivante o repressivo dell’istone segna, rispettivamente di2,3. Di conseguenza, mappe di modifica globale dell’istone, noto anche come epigenomic mappe, sono emersi come strumenti potenti e universali per annotare funzionalmente i genomi di vertebrati4,5. Ad esempio, sequenze regolatrici distale come rinforzatori possono essere identificati in base la presenza di firme di cromatina specifici (ad es., esaltatori di attivo: H3K4me1 e H3K27ac), che li distinguono dalle regioni promotore prossimale (per esempio, promotori attivi: H3K4me3)6,7,8. D’altra parte, i geni con funzioni di regolamentazione di identità delle cellule principali si trovano tipicamente con domini di cromatina ampio contrassegnati con H3K4me3 o H3K27me3, a seconda dello stato trascrizionalmente attivo o inattivo dei geni sottostanti, rispettivamente9 ,10. Allo stesso modo, l’espressione di geni di identità delle cellule principali sembra essere controllato frequentemente dal multiplo e spazialmente cluster rinforzatori (cioè, Super-rinforzatori), che possono essere identificati come vasto H3K27ac-contrassegnato domini11.

Attualmente, istone modifica mappe vengono generate utilizzando la tecnologia ChIP-seq, che rispetto alle precedenti approcci come ChIP-chip (ChIP accoppiato ai microarray) fornisce maggiore risoluzione, meno artefatti, meno rumore, copertura superiore e inferiore Costa12. Tuttavia, la generazione di mappe di epigenomic utilizzando la tecnologia ChIP-seq ha i suoi limiti intrinseci, principalmente connesse con la capacità di eseguire correttamente il ChIP nei campioni di interesse. Protocolli di ChIP tradizionali in genere necessari milioni di cellule, che limitano l’applicabilità di questo metodo al cellulare in vitro linee o cellule che può essere facilmente isolato in vivo (ad esempio, cellule del sangue). Negli ultimi anni, un numero di protocolli di ChIP modificate compatibile con numeri di cellulare bassa è stati descritti13,14,15,16. Tuttavia, questi protocolli sono progettati specificamente per essere accoppiato con sequenziamento di nuova generazione (cioè, ChIP-seq) e che in genere utilizzano hoc biblioteca preparazione metodi13,14, 15 , 16.

Qui, abbiamo descritto un protocollo di ChIP che può essere utilizzato per analizzare i profili di modifica dell’istone utilizzando numeri di basso a intermedio delle cellule (5 x 104 – 5 x 105 cellule) sia selezionato loci (cioè, ChIP-qPCR) o a livello globale (cioè, ChIP-seq) (Figura 1). Quando accoppiato alla tecnologia ChIP-seq, il nostro protocollo di ChIP può essere utilizzato insieme ai metodi di preparazione della libreria standard, rendendo così largamente accessibile a molti laboratori10. Questo protocollo è stato utilizzato per indagare parecchi contrassegni istone (ad es., H3K4me3, H3K27me3 e H3K27ac) in tessuti embrionali di pollo diversi (ad es., tubo neurale spinale (SNT), frontonasale protuberanze ed epiblasto). Tuttavia, possiamo anticipare che dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altri organismi in cui biologicamente e/o clinicamente rilevanti campioni possono essere ottenuti solo in basse quantità.

Protocol

secondo linee guida tedesca di cura degli animali, approvazione istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) non era necessario per eseguire gli esperimenti di embrione di pollo. Secondo le linee guida locali, solo esperimenti con embrioni di pollo HH44 (18 giorni) e più anziani richiedono approvazione IACUC. Tuttavia, gli embrioni utilizzati in questo studio erano tutti nelle prime fasi dello sviluppo embrionale (cioè, HH19 (72 h)). Nota: lo scopo del presente protocollo è…

Representative Results

Per illustrare le prestazioni del nostro protocollo di ChIP, abbiamo effettuato esperimenti utilizzando pool SNT sezioni da embrioni di pollo HH19, protuberanze maxillary della HH22 pollo embrioni ed embrioni di pollo di fase-HH3 per indagare i profili di associazione di ChIP-seq varie modifiche dell’istone (cioè, H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 e H3K27me3). Una volta che sono stati ottenuti ChIP “DNAS”, l’efficienza di sonicazione è stata valutata tramite l’elettroforesi del gel del…

Discussion

Epigenomic profilatura di modifica dell’istone utilizzando ChIP-seq può essere utilizzato per migliorare l’annotazione funzionale dei genomi di vertebrati in diversi contesti cellulari4,5,18. Questi profili di epigenomic possono essere utilizzati, tra le altre cose, per identificare gli elementi enhancer, per definire lo stato normativo di esaltatori di (cioè, attivo, innescato, o in bilico) e per definire regolatori …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Jan Appel per la sua eccellente assistenza tecnica durante l’istituzione del presente protocollo. Lavoro in laboratorio Rada-Iglesias è supportato da CMMC intramurale finanziamenti, sovvenzioni di ricerca DFG (2547/1-1 RA, RA 2547/2-1 e TE 1007/3-1), il ricercatore avanzato UoC gruppo Grant e la concessione di CECAD.

Materials

Reagent
BSA powder Carl Roth 3737.3
Phosphate Saline buffer (PBS) Sigma Aldrich D8537
Tris-HCL pH8.0 Sigma Aldrich T1503
NaCl Carl Roth 3957.2
EDTA Carl Roth 8043.2
EGTA Carl Roth 3054.2
Na-Deoxycholate Sigma Aldrich D6750-24
N-lauroylsarcosine Sigma Aldrich 61743-25G
Hepes Applichem A3724,0250
LiCl Carl Roth 3739.2
NP-40 Sigma Aldrich I3021-100ml
SDS Carl Roth 1833
Protein G/magnetic beads Invitrogen 1004D
37% Formaldehyde Sigma Aldrich 252549-1L
Glycine
RNase Peqlab 12-RA-03
Proteinase K Sigma Aldrich 46.35 E
Na-butyrate Sigma Aldrich SLB2659V
Proteinase inhibitor Roche 5892791001
SYBRgreen Mix biozym 617004
dH2O Sigma Aldrich W4502
1Kb ladder Thermofisher SM1333
Orange G Sigma Alrich 03756-25
Agarose Invitrogen 16500-500
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-072
Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) Roth 3051.4
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) Gibco 31331-028
Gel loading tips Multiflex A.Hartenstein GS21
qPCR Plates Sarstedt 721,985,202
384 well Sarstedt 721,985,202
1.5 mL tubes Sarstedt 72,706
100-1000µl Filter tips Sarstedt 70,762,211
2-20µl Filter tips Sarstedt 70,760,213
2-200µl Filter tips Sarstedt 70,760,211
0.5-10µl Filter tips Sarstedt 701,116,210
H3K27me3 antibody Active Motif 39155
H3K27ac antibody Active Motif 39133
H3K4me3 antibody Active Motif 39159
H3K4me2 antibody Active Motif 39141
End Repair Mix Illumina FC-121-4001
Paramagnetic beads Beckman Coulter A63881
Resuspension buffer Illumina FC-121-4001
A-Tailing Mix Illumina FC-121-4001
Ligation Mix Illumina FC-121-4001
RNA Adapter Indexes Illumina RS-122-2101
Stop Ligation Buffer Illumina FC-121-4001
PCR Primer Cocktail Illumina FC-121-4001
Enhanced PCR Mix Illumina FC-121-4001
Genomic DNA ladder Agilent 5067-5582
Elution Buffer Agilent 19086
Sample Buffer Agilent 5067-5582
Library Quantification Kit Kapa Biosystems KK4835 – 07960204001
Fertile chicken white eggs LSL Rhein Main KN: 15968
Needle (Neoject) A.Hartenstein 10001
Syringe (Ecoject 10ml) Dispomed witt oHG 21010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Centrifuge Hermle Z 216 MK
Thermoshaker ITABIS MKR13
Sonicator Active Motive EpiShear probe sonicator
Sonicator Diagenode Bioruptor Plus
Rotator Stuart SB3
Variable volume (5–1,000 μl) pipettes Eppendorf N/A
Timer Sigma N/A
Magnetic holder Thermo Fisher DynaMag-2 12321D
Table spinner Heathrow Scientific Sprout
Mixer LMS VTX 3000L
Real-Time PCR Cycler Roche Light Cycler; Serial Nr.5662
PCR Cycler Applied Biosystems Gene Amp PCR System 9700
DNA and RNA quality control system Agilent Agilent 4200 TapeStation System
Forceps Dumont 5-Inox-H
Perforated spoon World precision instruments 501997

References

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Cite This Article
Rehimi, R., Bartusel, M., Solinas, F., Altmüller, J., Rada-Iglesias, A. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples. J. Vis. Exp. (126), e56186, doi:10.3791/56186 (2017).

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