Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix
Summary
Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.
Abstract
Xeno-vrije en volledig gedefinieerde condities zijn belangrijke parameters voor robuuste en reproduceerbare generatie van homogene, geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen. Onderhoud van hiPS-cellen op feedercellen of ongedefinieerde matrices zijn vatbaar voor batchafwijkingen, pathogene verontreiniging en risico op immunogeniciteit. Het gebruik van de gedefinieerde recombinant humane laminin 521 (LN-521) matrix in combinatie met xenovrije en gedefinieerde media formuleringen vermindert de variabiliteit en zorgt voor een consistente generatie van hiPS cellen. De Sendai-virus (SeV) -vector is een niet-integrerend RNA-systeem, waardoor problemen die verband houden met het potentiële ontwrichtende effect op genoomintegriteit die integratie-vectoren kunnen hebben, worden omzeild. Bovendien hebben deze vectoren relatief hoog rendement bij de herprogrammering van dermale fibroblasten aangetoond. Bovendien vergemakkelijkt enzymatische single cell passage van cellen homogeen onderhoud van hiPS cellen zonder aanzienlijke eerdere ervaring van stamcellenLl cultuur. Hier beschrijven we een protocol dat uitgebreid getest en ontwikkeld is met een focus op reproduceerbaarheid en gebruiksgemak, waardoor een robuuste en praktische manier is om gedefinieerde en xeno-vrije humane hiPS-cellen van fibroblasten te genereren.
Introduction
Sinds de eerste afleiding van hiPS-cellijnen door Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS cellen hebben een nuttig hulpmiddel voor ziekte modelleren, drug ontdekking en als bronmateriaal voor het genereren van celtherapieën in regeneratieve geneeskunde 3 verschaft . HiPS celcultuur is al lang afhankelijk van co-cultuur met fibroblast feedercellen 4 , 5 of op Matrigel 6 en met media formuleringen die foetaal boviene serum (FBS) bevatten. Batch-to-batch varianties zijn een gemeenschappelijk gevolg van de ongedefinieerde aard van deze cultuuromstandigheden, wat resulteert in onvoorspelbare variaties, die een belangrijke bijdrage leveren aan de onbetrouwbaarheid van deze protocollen 7 . De ontwikkeling van gedefinieerd medium, zoals essentiële 8 (E8) 8 en gedefinieerde celkweekmatrices, bijvoorbeeld LN-521 9 , toestaanS voor de oprichting van hoogst reproduceerbare protocollen en hulp bij de robuuste generatie en het onderhoud van homogene hiPS cellen 7 , 8 , 9 , 10 .
Ontwikkeling van integratie gratis herprogrammeringstechnieken is een stap vooruit. Oorspronkelijk was herprogrammering afhankelijk van retrovirale vectoren die willekeurig in het genoom geïntegreerd werden met verstorende effecten op genomische integriteit 11 . Voorschotten in herprogrammeringsmethoden omvatten de ontwikkeling van RNA-gebaseerde vectoren. RNA-vectoren hebben een voordeel ten opzichte van de DNA-gebaseerde herprogrammeringsmethode aangezien onbedoelde integratie via genomische recombinatie niet mogelijk is 12 . SeV-vectoren verschaffen hoge en voorbijgaande expressie van exogene factoren door enkelstrengs RNA zonder een DNA-fase 11 . De herprogrammerende vectoren geleverd door de SeVWorden door de celuitbreiding verdund en worden uiteindelijk uit de cultuur afgevoerd, waardoor een vrije afdrukmogelijkheid voor fotoprints mogelijk is. Daarna is het onderhoud van pluripoten afhankelijk van endogene expressie van de pluripotentiegenen 2 .
Aangezien pioniersvolle therapieën van HiPS-cel beginnen te verplaatsen naar klinische proeven, zijn de eisen aan gestandaardiseerde partijen, reproduceerbaarheid en veiligheid essentiële problemen om 13 aan te pakken. Daarom moeten producten van dierlijke oorsprong worden vermeden. Bijvoorbeeld, het gebruik van xenogene producten is geassocieerd met het risico op nonhuman pathogeen besmetting. Ook hebben cellen die zijn gekweekt in aanwezigheid van dierlijke afgeleide cultuurcomponenten, aangetoond dat niet-humane siliaczuren in celmembranen worden opgenomen, die dreigen om afgeleide cellen immunogene 14 te maken . Daarom is de noodzaak om xenogene producten te elimineren nodig voor toekomstige klinische werkzaamheden. Dit protocol is van toepassing op xeGeen-vrije en gedefinieerde cultuur bij het behoud van hiPS-cellen die cellen dichter bij de klinische naleving bewegen.
Dit protocol beschrijft een consistente, zeer reproduceerbare en makkelijk te gebruiken methode die gestandaardiseerde hiPS cellen van fibroblasten genereert. Het biedt ook een gebruiksvriendelijk cultuursysteem voor het behoud van gevestigde hiPS-cellen. Dit protocol is gebruikt om meer dan 300 hiPS-cellijnen af te leiden in de Zweedse nationale menselijke iPS Core-faciliteit van het Karolinska Institutet, waarvan sommige lijnen eerder 15 , 16 zijn beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verwachte resultaat van dit protocol is de succesvolle opwekking van verschillende clonaal afgeleide hiPS-cellijnen. Belangrijk is dat de methode voor het onderhoud en uitbreiding van gevestigde hiPS-cellen hier beschreven, betrouwbaar is en kan worden uitgevoerd met weinig eerdere ervaring van stamcelcultuur. Enzymatische single cell passaging met ROCKi samen met de LN-521 matrix is bekend om cellen als karyotypisch normaal, pluripotent te handhaven en gemakkelijk in staat te differentiëren, terwijl geïndus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door SSF (B13-0074) en VINNOVA (2016-04134) financieringsagenten.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
