التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521
Summary
تم تحقيق اشتقاق قوي من الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبس) باستخدام فيروس سينداي غير متكامل (سيف) ناقلات بوساطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. تم تنفيذ صيانة الخلايا هيبس والتوسع النسيلي باستخدام ظروف زراعة خالية من الكينو و كيميائيا مع المؤتلف الإنسان لامينين 521 (لن-521) مصفوفة و E8 الأساسية (E8) المتوسطة.
Abstract
وتعتبر الظروف الخالية من الغينو والظروف المحددة تماما معلمات أساسية للتوليد القوي والقابل للتكاثر للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان. صيانة خلايا هيبس على الخلايا المغذية أو المصفوفات غير محددة عرضة للفروق دفعة، التلوث المسببة للأمراض وخطر المناعة. استخدام المصفوفة الإنسان لامينين 521 (لن-521) المؤتلف محددة في تركيبة مع تركيبات وسائل الإعلام خالية من شينو ومحددة يقلل من التباين ويسمح للجيل ثابت من خلايا هيبس. ناقل فيروس سينداي (سيف) هو نظام غير قائم على الحمض النووي الريبي القائم على الحمض النووي الريبي، وبالتالي التحايل على المخاوف المرتبطة التأثير المحتمل التخريبية على سلامة الجينوم نواقل دمج يمكن أن يكون. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه النواقل كفاءة عالية نسبيا في إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. وبالإضافة إلى ذلك، الأنزيمية خلية واحدة تمرير الخلايا يسهل صيانة متجانسة من خلايا هيبس دون خبرة سابقة كبيرة من الجذعية سيليرة لبنانية الثقافة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم اختباره على نطاق واسع وتطويرها مع التركيز على استنساخ وسهولة الاستخدام، وتوفير وسيلة قوية وعملية لتوليد وخلايا هيبس الإنسان محددة وخالية من خلايا الخلايا الليفية.
Introduction
منذ اشتقاق الأول من خطوط الخلايا هيبس تاكاهاشي وآخرون. 1 ، 2 ، وقد وفرت خلايا هيبس أداة مفيدة لنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات وكمادة المصدر لتوليد العلاجات خلية في الطب التجديدي 3 . وقد اعتمدت ثقافة الخلايا هيبس منذ فترة طويلة على المشاركة في الثقافة مع الخلايا المغذية الليفية 4 ، 5 أو على ماتريجيل 6 ومع تركيبات وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين (فبس). وتعتبر الفروق بين الدفعة والدفعة نتيجة شائعة للطبيعة غير المعرفة لظروف الثقافة هذه، مما يؤدي إلى تغيرات لا يمكن التنبؤ بها، وهي مساهمة رئيسية في عدم موثوقية هذه البروتوكولات 7 . تطوير وسط محدد مثل الأساسية 8 (E8) 8 والمصفوفات ثقافة الخلية المعرفة على سبيل المثال لن-521 9 ، تسمحثانية لإنشاء بروتوكولات استنساخه للغاية والمساعدات في توليد قوي وصيانة خلايا هيبس متجانسة 7 ، 8 ، 9 ، 10 .
وقد كان تطوير تقنيات إعادة البرمجة الحرة للتكامل قفزة إلى الأمام. في الأصل، إعادة البرمجة تعتمد على ناقلات الفيروسات الرجعية التي تدمج عشوائيا في الجينوم مع الآثار التخريبية على سلامة الجينومية 11 . وتشمل التطورات في منهجيات إعادة البرمجة تطوير النواقل القائمة على الحمض النووي الريبي. ناقلات الحمض النووي الريبي لديها ميزة على طريقة إعادة برمجة الحمض النووي على أساس التكامل غير مقصود من خلال إعادة التركيب الجيني غير ممكن 12 . تقدم ناقلات سيف التعبير عالية وعابرة من العوامل الخارجية من خلال الحمض النووي الريبي واحد تقطعت بهم السبل دون مرحلة الحمض النووي 11 . ناقلات إعادة البرمجة التي قدمها سيفيتم تخفيفها في جميع أنحاء التوسع الخلية وتسليط الضوء في نهاية المطاف من الثقافة توفير وسيلة الطباعة القدم الحرة لإعادة البرمجة. بعد ذلك، الحفاظ على تعدد القدرات يعتمد على التعبير الداخلي للجينات تعدد القدرات 2 .
كما بدأت الرائدة هيبس الخلايا القائمة على العلاجات للانتقال إلى التجارب السريرية، والمطالب على دفعات موحدة، استنساخ، والسلامة هي القضايا الأساسية لمعالجة 13 . ولذلك، ينبغي تجنب المنتجات ذات الأصل الحيواني. على سبيل المثال، كان استخدام المنتجات زينوجينيك مرتبطا بمخاطر التلوث غير المسببة للأمراض الممرضة. أيضا، وقد ثبت الخلايا المستزرعة في وجود مكونات الحيوانات المشتقة الحيوانية لدمج الأحماض السيلياك غير البشرية في أغشية الخلايا التي تهدد لتقديم الخلايا المستمدة المناعية 14 . وبالتالي، فإن الحاجة إلى القضاء على المنتجات زينوجينيك ضروري لأي ملاحقات السريرية في المستقبل. ينطبق هذا البروتوكول زلا حرة وتعرف الثقافة في الحفاظ على خلايا هيبس تتحرك الخلايا أقرب إلى الامتثال السريرية.
يصف هذا البروتوكول متسقة، استنساخه للغاية وسهلة الاستخدام الأسلوب الذي يولد خلايا هيبس موحدة من الخلايا الليفية. كما أنه يوفر نظام ثقافة سهل الاستعمال للحفاظ على خلايا هيبس أنشئت. وقد استخدم هذا البروتوكول لاشتقاق أكثر من 300 خطوط الخلايا هيبس في منشأة إيبس الأساسية الوطنية السويدية في معهد كارولينسكا منها بعض خطوط سبق وصفها 15 ، 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
النتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو الجيل الناجح لعدة خطوط الخلايا هيبس المستمدة كلونالي. الأهم من ذلك، فإن طريقة لصيانة وتوسيع خلايا هيبس أنشئت هنا هو موثوق بها ويمكن أن يؤديها مع القليل من الخبرة السابقة من ثقافة الخلايا الجذعية. ومن المعروف أن الأنزيمية خلية وا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل سف (B13-0074) و فينوفا (2016-04134) وكلاء التمويل.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
