Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. ^{1 , 2} , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. ³ . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками ^{4 , 5} или Matrigel ⁶ и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются общим следствием неопределенного характера этих условий культуры, что приводит к непредсказуемым изменениям, что является основным фактором ненадежности этих протоколов ⁷ . Разработка определенной среды, такой как Essential 8 (E8) ⁸ и определенные матрицы клеточной культуры, например LN-521 ⁹ , позволяютS для установления высоковоспроизводимых протоколов и помощи в надежной генерации и поддержании гомогенных клеток hiPS ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Развитие методов бесплатного перепрограммирования интеграции было скачком вперед. Первоначально перепрограммирование зависело от ретровирусных векторов, которые случайным образом интегрировались в геном с разрушительным воздействием на геномную целостность ¹¹ . Достижения в методологиях перепрограммирования включают разработку векторов на основе РНК. РНК-векторы имеют преимущество перед методом репрограммирования на основе ДНК, поскольку непреднамеренная интеграция через геномную рекомбинацию невозможна ¹² . SEV-векторы обеспечивают высокую и временную экспрессию экзогенных факторов посредством одноцепочечной РНК без ДНК-фазы ¹¹ . Перепрограммирующие векторы, поставляемые SeVРазводят по всему клеточному расширению и, в конце концов, избавляются от культуры, обеспечивая свободный способ перепрограммирования. После этого поддержание плюрипотентности зависит от эндогенной экспрессии плюрипотентных генов ² .

Поскольку новаторские методы терапии на основе hiPS начинают переходить в клинические испытания, требования к стандартизованным партиям, воспроизводимости и безопасности являются важными проблемами для решения проблемы ¹³ . Поэтому следует избегать продуктов животного происхождения. Например, использование ксеногенных продуктов связано с риском заражения нечеловеческим патогеном. Было показано, что клетки, культивируемые в присутствии компонентов культуры животного происхождения, включают в себя нечеловеческие силикатные кислоты в клеточные мембраны, которые угрожают сделать производные клетки иммуногенными ¹⁴ . Следовательно, необходимость устранения ксеногенных продуктов необходима для любых будущих клинических занятий. Этот протокол применяется xeБесплодная и определенная культура в поддержании клеток hiPS, перемещающих клетки ближе к клиническому соблюдению.

Этот протокол описывает последовательный, очень воспроизводимый и простой в использовании метод, который генерирует стандартизованные клетки hiPS из фибробластов. Он также предлагает удобную систему культивирования для обслуживания установленных hiPS-камер. Этот протокол был использован для получения более 300 линий клеточных линий hiPS на шведском национальном объекте iPS Core человека в Каролинском институте, из которых некоторые линии ранее были описаны ^{15 , 16} .