וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה
Summary
כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג’ין MSC.
Abstract
אנגיוגנזה הוא תהליך מורכב, בעלות רגולציה האחראי על מתן ותחזוקה נאותה רקמות זלוף. להערכת לא מספקת תחזוקה, מומים פתולוגי עלול לגרום מחלות איסכמיים חמורים, בזמן פיתוח כלי הדם יתר על המידה שופע קשורה עם סרטן והפרעות דלקתיות. טופס המבטיחים של pro-אנגיוגנזה טיפול הוא השימוש של מקורות תא האנגיוגנזה, אשר יכול לספק גורמים רגולטוריים, כמו גם תמיכה פיזית לפיתוח החדש להערכת.
Mesenchymal תאי סטרומה (MSCs) הם מועמדים ובדוקים בהרחבה עבור התחדשות כלי הדם עקב תופעות paracrine שלהם והיכולת שלהם ויוכל הביתה לרקמות איסכמי או מודלק. בפרט, בשליש הראשון הטבור האנושי perivascular תאים (FTM HUCPVCs) הם מועמד מבטיח מאוד בשל תכונות כמו pericyte, פוטנציאל גבוה המקדימות, multilineage, תכונותיהם החיסון-חסוי, ואת paracrine חזקים פרופיל. כדי להעריך באופן יעיל פוטנציאל תאים משובי האנגיוגנזה, זה נדרשת כדי לבדוק אותם אמין ואת מבחני פרה-קליניים “לתרגם”. וזמינותו הטבעת אבי העורקים הוא שמחוץ אנגיוגנזה מודל זה מאפשר כימות קל של מבנים צינורי אנדותל, מספק מטריצה חוץ-תאית (ECM) והתאים תומכת אביזר מהמחשב המארח, אינה כוללת מרכיבים דלקתיים וכן מהיר ולא יקר להגדיר. זה יתרון בהשוואה ויוו מודלים (למשל, וזמינותו הקרנית, Matrigel תקע assay); וזמינותו הטבעת אבי העורקים באפשרותך לעקוב אחר התאים מנוהל ולצפות אינטראקציות המערכת תוך הימנעות דחייה קסנו-החיסון.
אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים, אשר כוללת MSCs אנושי בתרבויות שיתוף עם עכברוש בפיתוח רשתות אנדותל אבי העורקים. Assay זו מאפשרת הניתוח של התרומה MSC צינור היווצרות והתפתחות דרך אינטראקציות pericyte דמוי הפיזי, עוצמה להעברת פעיל לאתרים של אנגיוגנזה, להערכת יכולתם לבצע ולסיים עיבוד ECM. פרוטוקול זה מספק מידע נוסף על השינויים פנוטיפ MSC ביטוי הגן בעקבות תרבות משותפת.
Introduction
תהליך מורכב של אנגיוגנזה משפר ושומר זלוף רקמות באמצעות קידום התפתחות כלי דם חדשים מראש קיימים להערכת1. זה תהליך מוסדר בחוזקה, מאוזנת על ידי גורמים פרו-אנגיוגנזה, אנטי-אנגיוגנזה. כל ליקוי במערכת זו עלולה להוביל לא מספקת כלי תחזוקה או צמיחה, גורמות למחלות איסכמי חמורות, לרבות מחלת שריר הלב, שבץ מוחי הפרעות ניווניות. אולם, פיתוח כלי הדם מוגזמת הוא מאפיין עבור תנאים לרבות סרטן, הפרעות דלקתיות2.
פיתוח טיפולים שמטרתם לשלוט אנגיוגנזה להשגת התחדשות רקמות חיובית יש חשיבות מפתח. למרות חקירות קליניות נרחב, ניסיונות לעורר אנגיוגנזה באמצעות גורמי אנגיוגנזה pro ומיקרו Rna נכשלו להשיג תוצאות3,4,5. הסיבות האפשריות ההשפעות ארעי כוללים: אריכות ימים מצומצם של אנגיוגנזה חלבונים, חומצות גרעין, מספר סופי של ממוקד גורמי גדילה6,7. למרות גורמי אנגיוגנזה מסיסים חיוני לאתחול אנגיוגנזה, תחזוקת והפונקציונליות של להערכת תלויים תמיכה סוגי תאים כולל תאים pericytes, שריר חלק8. בתחום של טיפולים pro-אנגיוגנזה בוחנת כעת והוא תא גזע קדמון תא מקורות פוטנציאליים היכולים לספק גורמי אנגיוגנזה באופן מקומי, תוך תמיכה פיזית לאחרונה פיתחה להערכת, חידוש עצמי או אפילו הבחנה לתוך תאי אנדותל-כמו9,10. מציאת אנגיוגנזה האופטימלית סוגי תאים עם היכולת למלא את דרישות פונקציונלי אלה מחזיקה הבטחה גדולה עבור התחדשות רקמות איסכמי.
על מנת בהצלחה לתרגם טיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים ניסויים קליניים, מחקרים קליניים צריך להדגים את יעילותם וסמן את המנגנונים האנגיוגנזה הבסיסית. למרות המספר הגבוה של מבחני הוקמה אנגיוגנזה, השדה חסר “תקן הזהב” במבחנה assay אמין יכול להעריך את היעילות של פוטנציאל המועמד תא סוגי11,12, 13. רוב במבחנה אנגיוגנזה מבחני (כולל את מבחני היווצרות אנדותל של התפשטות, הגירה, צינור) בדרך כלל להעריך את ההשפעות של תאים או תרכובות על תאי אנדותל שינויים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר או בידול לתוך צינורי ומבנים רשת14,15. ואילו תכונות אלה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה, וזמינותו “לתרגם” אמור להעריך גם: 1) הגדלת או החלפה של סוגי תאים התומכים כולל pericytes או תאי שריר חלק, 2) עיבוד של ה-ECM ו/או קרום המרתף, ו- 3). היעילות לקדם היווצרות של microvasculature תפקודית. In vivo אנגיוגנזה דגמים, כולל את assay הקרנית ואת וזמינותו הכנס Matrigel, לסכם את microenvironment ייחודי ויוו אך מאותגרים על ידי הקושי של תאים מעקב מנוהל להתבונן באינטראקציה גופנית. יתר על כן, אין ויוו דגמים, דחייה קסנו-החיסון יכול להתרחש תוך בדיקת פוטנציאל allogeneic התא טיפול מועמדים16. Ex-vivo מודלים אנגיוגנזה, במיוחד וזמינותו הטבעת אבי העורקים יכולה לספק: תצפית 1) קל, כימות של מבנים צינורי, תאים תומכים אביזר 2), 3) ECM של המארח ואספקה מלאכותי, 4) אי-הכללה של דלקתיות רכיבים, ו- 5) התקנה מהירה וזולה17,18. בדרך כלל, וזמינותו הטבעת אבי העורקים ניתן לבדוק את הפוטנציאל אנגיוגנזה של חלבונים הפרשה קטן, סוכנים תרופתי מודלים מהונדס מכרסמים19,20,21.
MSCs הם מועמדים מבטיחים עבור התחדשות כלי דם בעיקר דרך שלהם paracrine בתיווך ההשפעות22,23,24. MSCs הוכחו מפרישים גורמי אנגיוגנזה מפתח כולל כלי הדם אנדותל פקטורי גדילה (VEGF), גורם הגדילה Hepatocyte (דבורה שחר), דמויי אינסולין Growth Factor 1 (IGF-1) בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF), angiopoeitin-1 (אנג-1)25 ,26. MSCs יכול גם לזהות, רקמות הביתה איסכמי או מודלק, עם זאת, המנגנון המדויק עדיין בחקירה. יותר ויותר, הספרות תומך את ההשערה כי רוב MSCs נובעים perivascular תאים משותפת אקספרס סמנים pericyte, יכולה להתנהג כמו pericytes27. HUCPVCs הם המקור הצעיר של MSCs נגזר מאזור perivascular של הטבור אנושי. הם מייצגים אוכלוסיה של MSCs עם תכונות כמו pericyte, מאפינים של חוטי חבל הטבור FTM והן לטווח. FTM HUCPVCs להדגים ביטוי גבוהה של סמנים pericyte כולל המאפיינים החיסון-מורשה CD146 ו- NG2, פוטנציאל המקדימות, multilineage גבוה, ולהציג פרופיל28paracrine חזקים. FTM HUCPVCs הם מסוג תא המועמד האידיאלי כדי לקדם התחדשות של הרקמה הפצועים קידום חדש להערכת באמצעות תכונות כמו pericyte שלהם.
כדי לבדוק את הפוטנציאל האנגיוגנזה והמאפיינים pericyte כמו של MSCs האנושית, מספר מאוד מצומצם של מבחני אנגיוגנזה הם ההעברה angiotropic זמין שם חיובי (ןלהל “יונת”), ECM עיבוד ופיתוח גופניים האינטראקציות בין סוגי תאים יכול ייחקרו, תוך קבלת נתונים כמותיים על פיתוח microvasculature.
בזאת אנו מציגים פרוטוקול המתאר שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים. MSCs האנושי היו בתרבית במשותף עם פיתוח חולדה-derived אבי העורקים אנדותל רשתות כדי להעריך את תרומתם צינור היווצרות ההבשלה, הומאוסטזיס. גירסה זו של הטבעת אבי העורקים וזמינותו מעריך את היכולת ואת העוצמה המועמדים טיפול תא הביתה לאתרים של אנגיוגנזה, לבצע לתווך ECM עיבוד ושל תורמים להתפתחות צינורי אנדותל באמצעות הקמת פיזית כמו pericyte אינטראקציות. בנוסף לכימות ההשפעה נטו של MSCs על היווצרות רשת אנדותל במבחנה התבוננות אינטראקציות המערכת, אנחנו גם אופטימיזציה פרוטוקול כדי לבודד MSCs מתרבויות משותף. על ידי ביצוע cytometry זרימה, qPCR, זה אפשרי לאפיין שינויים פנוטיפ MSC ביטוי הגן בעקבות תרבות משותפת. בתור דגם סוגי תאים, השווינו ontogenetically מוקדם (טרום לידתי) ומקורות מאוחר (כמבוגר) של MSCs אנושי: FTM HUCPVCs ואת האדם הנגזרות מח עצם MSCs (BMSC), בהתאמה, בעוד וזמינותו הטבעת אבי העורקים. אנו מציעים כי וזמינותו הטבעת אבי העורקים ניתן ללמוד את הפוטנציאל האנגיוגנזה מכל סוג התא תמיכה פיזית כאשר תחת חקירה עבור יישומים משובי אנגיוגנזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים בהגדרת assay מוצלחת הטבעת אבי העורקים MSC תרבות משותפת הניסוי. ראשית, השלבים החשובים ביותר כאשר לבודד את חלוקתה אבי העורקים הם: 1) קבלת באופן בלעדי על קטע בית החזה של אבי העורקים; 2) הסרת בזהירות מסעף כלי הדם, החיבור, רקמת שומן ו; 3) חיתוך קטעים אפילו של אבי העורקים (~ 1 מ מ) כדי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה חברי הצוות הבאה ומחקר אנשי צוות: אנדרה גותייה-פישר, מתיו Librach, טניה ברטו, Tharsan Velauthapillai, שרה Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
