والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر
Summary
هنا، نقدم تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر التي تكون فيها الخلايا الوسيطة بريلابيليد مثقف يشترك مع شبكات غشائي المستمدة من الشريان الاورطي الفئران. يسمح هذا الأسلوب رواية التصور صاروخ موجه الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) والتكامل مع الشبكات بطانية، التحديد الكمي لخصائص الشبكة، وتقييم التعبير لجنة السلامة البحرية إيمونوفينوتيبيس والجينات.
Abstract
تولد الأوعية عملية معقدة وعالية التنظيم مسؤولاً عن توفير وصيانة نضح الأنسجة مناسبة. صيانة المفرج غير كافية والتشوهات المرضية يمكن أن ينتج الأمراض الدماغية الحادة، بينما يرتبط تطور الأوعية الدموية مفرط وفيرة مع السرطان وأمراض التهابات. نموذج واعدة برو-الأوعية العلاج هو استخدام الأوعية خلية المصادر، التي يمكن أن توفر العوامل التنظيمية، فضلا عن الدعم المادي لتطوير المفرج حديثا.
الخلايا الوسيطة Stromal (MSCs) مرشحتان التحقيق على نطاق واسع لتجديد الأوعية الدموية بسبب آثارها باراكريني وقدرتهم على كشف وموطنا للأنسجة الدماغية أو ملتهبة. على وجه الخصوص، في الفصل الأول الحبل السري البشري ارتشاح الخلايا (FTM هوكبفكس) مرشح واعدة جداً نظراً لخصائص مثل بيريسيتي، وإمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وخصائص المناعي المميز، و paracrine قوية الشخصية. لتقييم فعالية يحتمل أن تكون الأوعية خلايا التجدد، شرط مسبق لاختبار لهم في موثوقية وفحوصات ما قبل السريرية “قابل للنقل”. والرزن حلقة الابهر هو نموذج الأوعية السابقين فيفو يسمح لسهل التحديد الكمي لهياكل غشائي أنبوبي، يوفر خلايا داعمة التبعي والمصفوفة خارج الخلية (ECM) من البلد المضيف، ويستبعد مكونات التحريضية، وهو سريعة وغير مكلفة لإعداد. وهذا مفيد عند مقارنتها بنماذج في فيفو (مثلاً، فحص القرنية، مقايسة توصيل ماتريجيل)؛ يمكن تعقب الخلايا التي تدار المقايسة حلقة الابهر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا مع تجنب الرفض المناعي كرة.
نقدم بروتوكول لتطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر، الذي يشمل البشرية MSCs في الثقافات المشتركة مع النامية شبكات غشائي الابهري من الفئران. يسمح هذا الفحص لتحليل مساهمة لجنة السلامة البحرية أنبوب تشكيل والتنمية من خلال التفاعلات مثل بيريسيتي المادية وقوتها لنشاط الترحيل إلى مواقع للأوعية، وتقييم قدرتها على أداء والتوسط تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة. يوفر هذا البروتوكول مزيدا من المعلومات عن التغيرات في التعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشارك.
Introduction
يحسن عملية معقدة من الأوعية ويحافظ نضح الأنسجة من خلال تعزيز التنمية السفينة دماء جديدة من القائمة من قبل المفرج1. أنها عملية محكم التنظيم، ومتوازنة بعوامل برو-الأوعية والأوعية المضادة. قد يؤدي أي نقص في هذا النظام لصيانة السفينة غير كافية أو النمو، مما تسبب في الأمراض الدماغية الحادة بما في ذلك مرض احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية، واضطرابات الأعصاب. تطوير الأوعية الدموية مبالغ فيها غير مميزة للشروط بما في ذلك السرطان وأمراض التهابات2.
تطوير العلاجات التي تهدف إلى التحكم في الأوعية لتحقيق تجديد الأنسجة مواتية له أهمية رئيسية. على الرغم من التحقيقات السريرية والسريرية واسعة النطاق، فشلت محاولات لتنشيط الأوعية باستخدام عوامل برو-الأوعية وميكرورناس لتحقيق النتائج المرغوبة3،،من45. تتضمن الأسباب المحتملة لآثار عابرة: طول العمر المحدود للأوعية البروتينات والأحماض النووية، وعدد محدود من استهداف عوامل النمو6،7. على الرغم من أن الأوعية القابلة للذوبان عوامل ضرورية لبدء عملية تولد الأوعية، على الصيانة ووظائف من المفرج تعتمد على دعم أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء وبيريسيتيس8. مجال العلاجات برو-الأوعية الآن هو استكشاف مصادر خلية المحتملة الخلايا الجذعية، والسلف قد توفر عوامل الأوعية محلياً، بينما فعلياً دعم حديثا وضعه المفرج، تجديد ذاتية أو حتى التفريق في خلايا بطانية مثل9،10. إيجاد الأوعية الأمثل أنواع الخلايا مع القدرة على الوفاء بهذه المتطلبات الوظيفية يحمل وعدا كبيرا لتجديد الأنسجة الدماغية.
من أجل ترجمة العلاجات المحتملة يستند إلى الخلية بنجاح في التجارب السريرية، تحتاج الدراسات ما قبل السريرية إثبات فعاليتها وتسليط الضوء على الآليات الأوعية الكامنة. على الرغم من العدد الكبير من فحوصات الأوعية الثابتة، يفتقر المجال “المعيار الذهبي” في المختبر مقايسة التي موثوق يمكن تقييم الفعالية من المحتمل المرشح الخلية أنواع11،12، 13-معظم في المختبر الأوعية فحوصات (بما في ذلك فحوصات تشكيل الانتشار والهجرة وأنبوب غشائي) عادة تقييم آثار الخلايا أو مركبات على التغييرات الشكلية أو التمايز إلى خلايا بطانية أنبوبية وهياكل الشبكة14،15. بينما هذه الميزات حاسمة بالنسبة للأوعية، ينبغي أيضا تقييم مقايسة “قابل للنقل”: 1) تكبير أو استبدال أنواع الخلايا الداعمة بما في ذلك بيريسيتيس أو خلايا العضلات الملساء، 2) تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة و/أو الغشاء، و 3). كفاءة لتشجيع تشكيل ميكروفاسكولاتوري الوظيفية. في فيفو الأوعية النماذج، بما في ذلك فحص القرنية ومقايسة توصيل ماتريجيل، الخص المكروية فريدة من نوعها في فيفو ولكن تحدي عن الصعوبة في خلايا تتبع إدارة لمراقبة التفاعلات الفيزيائية. وعلاوة على ذلك، في فيفو النماذج، يمكن أن تحدث الرفض المناعي كرة بينما تقوم باختبار المرشحين العلاج خلية متمكنة المحتملة16. السابقين فيفو نماذج الأوعية، لا سيما مقايسة حلقة الابهر يمكن أن توفر: 1) السهل والمراقبة والتحديد الكمي لهياكل أنبوبية، وخلايا داعمة 2) التبعي، 3) ECM من المضيف واللوازم الصناعية، 4) الاستبعاد من الالتهابات المكونات، و 5) سريعة وغير مكلفة إعداد17،18. عادة، يمكنك اختبار الإنزيم حلقة الابهر إمكانات الأوعية الصغيرة البروتينات الافرازية، ووكلاء الدوائية، ونماذج القوارض المعدلة وراثيا19،،من2021.
MSCs هم المرشحين الواعدين لتجديد الأوعية الدموية أساسا من خلال23،22،paracrine بوساطة تأثيرات على24. MSCs قد ثبت أن تفرز عوامل الأوعية الرئيسية بما في ذلك الأوعية الدموية غشائي عامل النمو (VEGF)، تتمثل عامل النمو (هجف)، مثل الأنسولين عامل النمو-1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (بفجف) الأساسية، وأنجيوبويتين-1 (إنج-1)25 ،26. ويمكن أيضا الكشف عن MSCs وموطن الدماغية أو التهاب الأنسجة، ولكن الآليات الدقيقة ما زالت قيد التحقيق. متزايدة، والأدب تدعم الفرضية القائلة بأن MSCs معظم تنشأ من ارتشاح الخلايا، وشارك عن علامات بيريسيتي، ويمكن أن تتصرف مثل بيريسيتيس27. هوكبفكس مصدر شباب من MSCs المستمدة من منطقة ارتشاح في الحبل السري البشري. أنها تمثل أن MSCs مع خصائص مثل بيريسيتي واتسمت من الحبال السري FTM والأجل. هوكبفكس FTM إثبات تعبير عالية من علامات بيريسيتي بما في ذلك خصائص المناعي المميز CD146 وفي NG2، إمكانات عالية التكاثري ومولتيلينيجي، وعرض paracrine قوية الشخصية28. هوكبفكس FTM نوع خلية مرشح مثالي لتعزيز التجديد للنسيج المصاب من خلال تعزيز المفرج الجديدة عن طريق خصائصها مثل بيريسيتي.
لاختبار إمكانيات الأوعية وخصائص مثل بيريسيتي من MSCs البشرية، هي عدد محدود جداً من فحوصات الأوعية الهجرة المتاحة حيث الإيجابية أنجيوتروبيك (يشار إليه فيما يلي “صاروخ موجه”) وتجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة والتنمية البدنية يمكن أن يحقق التفاعلات بين أنواع الخلايا، في حين الحصول على بيانات كمية في التنمية ميكروفاسكولاتوري.
هنا نقدم بروتوكول يصف تطبيق رواية للمقايسة حلقة الابهر. وكانت MSCs البشرية مثقف يشترك مع النامية المستمدة من الفئران الابهري غشائي شبكات تقييم إسهامها في أنبوب تشكيل والنضج والتوازن. هذا الإصدار من مقايسة حلقة الابهر يقيم قدرة وفاعلية الخلية العلاج المرشحين الصفحة الرئيسية لمواقع الأوعية، نفذ والتوسط من أجل تجهيز إدارة المحتوى في المؤسسة، والإسهام في التنمية أنبوبي غشائي من خلال إنشاء البدنية مثل بيريسيتي التفاعلات. بالإضافة إلى التحديد الكمي للأثر الصافي من MSCs على تشكيل شبكة غشائي في المختبر ومراقبة التفاعلات بين الخلايا، ونحن أيضا الأمثل بروتوكولا لعزل MSCs من الثقافات المشتركة. عن طريق إجراء التدفق الخلوي وقبكر، فمن الممكن لوصف التغييرات في تعبير النمط الظاهري والجيني ماجستير أثر الثقافة المشتركة. كنموذج أنواع الخلايا، قارنا أونتوجينيتيكالي المبكر (قبل الولادة) وأواخر المصادر (الكبار) من MSCs البشرية: FTM هوكبفكس والبشرية المشتقة من نخاع العظم MSCs (بمسك)، على التوالي، في مقايسة حلقة الابهر. ونحن نقترح أن المقايسة خاتم الابهري يمكن استخدامها لدراسة إمكانات الأوعية من أي نوع الخلية الداعمة ماديا عند قيد التحقيق للتطبيقات التجدد الأوعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عدة مراحل حاسمة في إعداد مقايسة حلقة الابهر ناجحة ماجستير ثقافة المشارك التجربة. أولاً، أهم الخطوات عند عزل وتقطيع الشريان الاورطي: 1) الحصول على حصرا في الجزء الصدري من الشريان الاورطي؛ 2) بعناية إزالة الأوعية الدموية المتفرعة والضامة والأنسجة الدهنية و؛ 3) قطع المقاطع حتى من الشريان …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر الموظفين التالية وبحوث الأفراد: أندريه غوتييه-فيشر، ماثيو ليبراتش، تانيا باريتو، فيلاوتابيلاي ثارسان، وسارة لاروندي.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
