Le dosage de co-culture anneau aortique : Un outil pratique pour évaluer le potentiel angiogénique de cellules stromales mésenchymateuses In Vitro
Summary
Nous présentons ici une nouvelle application du test de l’anneau aortique où prémarqués cellules mésenchymateuses sont conjointement cultivés avec réseaux endothéliales dérivées aorte de rat. Cette nouvelle méthode permet la visualisation des homing cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et intégration aux réseaux endothéliales, quantification des propriétés du réseau et l’évaluation des MSC immunophenotypes et l’expression génique.
Abstract
L’angiogenèse est un processus complexe, fortement réglementé, responsable de fournir et de maintenir la perfusion tissulaire adéquate. Entretien de vascularisation insuffisante et des malformations pathologiques peuvent entraîner maladies ischémiques sévères, tandis que trop abondante développement vasculaire est associée avec le cancer et les troubles inflammatoires. Une forme prometteuse de pro-angiogénique thérapie est l’utilisation de sources de cellules angiogéniques, qui peuvent fournir des facteurs de régulation ainsi que le soutien physique pour développer nouvellement système vasculaire.
Cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont intensivement étudiés candidats pour régénération vasculaire en raison de leurs effets paracrine et leur capacité à détecter et abritant les tissus ischémiques ou enflammées. En particulier, premier trimestre des cellules du cordon ombilical humain périvasculaires (FTM HUCPVCs) sont un candidat très prometteur en raison de leurs propriétés pericyte, fort potentiel prolifératif et multilignée, privilège immunitaire propriétés et paracrine robuste Voir le profil. Evaluer efficacement potentiellement angiogénique cellules régénératrices, c’est une condition pour tester en fiable et « traduisible » essais précliniques. L’essai de l’anneau aortique est un modèle d’angiogenèse ex vivo qui permet pour la simple quantification des structures tubulaires d’endothéliales, fournit les accessoires cellules de soutien et de la matrice extracellulaire (MEC) de l’hôte, exclut les composantes inflammatoires et est rapide et peu coûteuse à mettre en place. Ceci est avantageux par rapport aux modèles in vivo (p. ex., cornée dosage, Matrigel prise test) ; l’essai de l’anneau aortique peut suivre les cellules administrées et observer les interactions intercellulaires tout en évitant le rejet de xeno-immunitaire.
Nous présentons un protocole pour une nouvelle application du test de l’anneau aortique, qui comprend les MSCs humaines dans des cultures co avec le développement de réseaux endothéliales aortiques de rat. Ce test permet l’analyse de la contribution de MSC dans le tube de formation et développement grâce à des interactions de type pericyte physiques et de leur puissance de migration activement aux sites de l’angiogenèse et pour évaluer leur capacité à effectuer et médiation Traitement de l’ECM. Ce protocole prévoit plus d’informations sur les changements MSC phénotype et l’expression génique suite co-culture.
Introduction
Le processus complexe de l’angiogenèse améliore et maintient la perfusion tissulaire en favorisant le développement de navire du sang neuf de préexistant vascularisation1. C’est un processus fortement réglementé, équilibré par des facteurs pro-angiogéniques et anti-angiogéniques. Toute carence dans ce système peut conduire à l’entretien insuffisant de navire ou de croissance, provoquant de graves maladies ischémiques, y compris la maladie myocardique, accident vasculaire cérébral et les maladies neurodégénératives. Cependant, développement vasculaire exagérée est caractéristique pour les conditions, y compris le cancer et les troubles inflammatoires,2.
Développement de thérapies visant à contrôler l’angiogenèse pour atteindre la régénération tissulaire favorable est d’une importance capitale. Malgré des recherches précliniques et cliniques approfondies, tentatives de stimuler l’angiogenèse à l’aide de micro-ARN et facteurs pro-angiogéniques ont échoué à atteindre les résultats souhaités3,4,5. Les raisons possibles pour les effets transitoires incluent : longévité limitée de protéines angiogéniques et acides nucléiques et le nombre fini de ciblée des facteurs de croissance6,7. Bien que les facteurs angiogéniques solubles sont essentiels pour initier l’angiogenèse, l’entretien et la fonctionnalité du système vasculaire dépendent supportant les types de cellules, y compris les péricytes et muscle lisse cellules8. Le domaine des thérapies pro-angiogénique étudie maintenant les sources potentielles de cellule cellules souches et progénitrices qui pourraient constituer des facteurs angiogéniques localement, tandis que physiquement soutenir nouvellement développé vascularisation, renouvellement automatique ou même différencier en cellules endothéliales9,10. Trouver l’angiogénique optimale des types de cellules ayant la capacité de répondre à ces exigences fonctionnelles est un très prometteur pour la régénération des tissus ischémiques.
Afin de les traduire avec succès des thérapies potentielles sur les cellules dans les essais cliniques, des études précliniques doivent démontrer leur efficacité et de mettre en évidence les mécanismes angiogéniques. Malgré le nombre élevé d’essais établis l’angiogenèse, le champ n’est pas un essai de « étalon-or » in vitro qui pourrait sûrement évaluer l’efficacité du potentiel candidat cell types11,12, 13. plupart in vitro l’angiogenèse essais (y compris les essais de formation tube, la migration et la prolifération endothéliales) généralement évaluer les effets des cellules ou des composés sur changements phénotypiques ou la différenciation en cellules endothéliales tubulaire et des structures de réseau14,15. Alors que ces caractéristiques sont essentielles pour l’angiogenèse, un test « traduisible » devrait également évaluer : 1) l’augmentation mammaire ou le remplacement des prise en charge types de cellules y compris les péricytes ou 2) le traitement des ECM ou membrane basale, les cellules musculaires lisses, et 3). l’efficacité pour promouvoir la formation de microcirculation fonctionnelle. Modèles in vivo angiogenèse, y compris le dosage cornéenne et Matrigel fiche dosage, récapitulent le microenvironnement unique in vivo mais sont contestées par la difficulté des cellules de suivi administré d’observer des interactions physiques. En outre, dans des modèles in vivo , rejet de xeno-immunitaire peut se produire lors du test de potentiels cellules allogéniques thérapie candidats16. Ex vivo angiogenèse modèles, en particulier le dosage de l’anneau aortique peut fournir : observation 1) facile et quantification des structures tubulaires, des cellules de soutien 2) accessoires, ECM 3) de l’hôte et fournitures artificiels, 4) exclusion d’inflammatoire composants et 5) installation rapide et peu coûteux de17,18. En règle générale, l’essai de l’anneau aortique peut tester le potentiel angiogénique de petites protéines sécrétoires, agents pharmacologiques et les modèles de rongeurs transgéniques19,20,21.
MSCs sont prometteurs pour la régénération vasculaire principalement par leurs effets médiés par les paracrine22,23,24. MSCs auraient dû être divulgués à sécréter des facteurs angiogéniques clés dont le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance des hépatocytes (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) et angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs peuvent également détecter et tissus abrite ischémique ou enflammés, cependant, les mécanismes exacts sont toujours sous enquête. De plus en plus, la littérature soutient l’hypothèse que MSCs la plupart proviennent des cellules périvasculaires, expriment co pericyte marqueurs et peuvent se comporter comme des péricytes27. HUCPVCs sont une source de jeune de MSCs, dérivée de la région périvasculaire du cordon ombilical humain. Ils représentent une population de MSCs ayant des propriétés pericyte et ont été caractérisés de FTM et à terme des cordons ombilicaux. FTM HUCPVCs démontrent une forte expression de marqueurs pericyte y compris CD146 et NG2, fort potentiel prolifératif et multilignée, propriétés immunitaires de privilèges et afficher une robuste paracrine profil28. FTM HUCPVCs sont un type de cellule du candidat idéal pour favoriser la régénération des tissus lésés par le biais de la promotion du nouveau système vasculaire par l’intermédiaire de leurs propriétés pericyte.
Pour tester le potentiel angiogénique et pericyte-comme des propriétés de MSCs humaines, un nombre très limité d’essais de l’angiogenèse est disponible où positive angiotropic migrations (ci-après dénommé « homing »), ECM traitement et développement de physique interactions entre les types de cellules peuvent être étudiées, tout en obtenant des données quantitatives sur le développement de la microcirculation.
Par les présentes, nous présentons un protocole décrivant une nouvelle application du test de l’anneau aortique. MSCs humaines ont été conjointement cultivés avec développement dérivée de rat aortiques endothéliale des réseaux afin d’évaluer leur contribution pour la formation, la maturation et l’homéostasie de tube. Cette version du test de l’anneau aortique évalue la capacité et la puissance des candidats de thérapie cellulaire Accueil aux sites de l’angiogenèse, effectuer et médiation traitement ECM, et contribuer à endothélial développement tubulaire en créant des pericyte forme physique interactions. En plus de la quantification de l’effet net de MSCs sur la formation de réseau endothéliales in vitro et en observant les interactions intercellulaires, nous avons également optimisé un protocole visant à isoler les MSCs des co-cultures. En effectuant de qPCR et cytométrie en flux, il est possible de caractériser les changements MSC phénotype et gene expression suite co-culture. En tant que types de modèle de cellule, nous avons comparé ontologiquement au début (prénatal) et des sources tardives (adultes) de MSCs humaines : FTM HUCPVCs et MSCs de moelle osseuse humaine (BMSC), respectivement, dans l’essai de l’anneau aortique. Nous proposons que l’essai de l’anneau aortique peut être utilisé pour étudier le potentiel angiogénique de n’importe quel type de cellule physiquement soutien lorsque incriminés pour applications régénératrice angiogénique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a plusieurs étapes essentielles à mettre en place un test réussie anneau aortique expérience de co-culture MSC. Tout d’abord, les étapes les plus importantes lorsque l’isolant et en sectionnant l’aorte sont : 1) obtenir exclusivement le segment thoracique de l’aorte ; 2) soigneusement enlever les vaisseaux sanguins ramifiés, conjonctif et le tissu adipeux et ; 3) coupe même des sections de l’aorte (~ 1 mm) pour limiter la variabilité entre chaque essai. Deuxièmement, l’intégration réussie d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercie les membres du personnel suivants et personnel de recherche : Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai et Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
