Assay Сопредседатель культуры аортального кольца: Удобным инструментом для оценки потенциала ангиогенных мезенхимальных стромальных клеток In Vitro
Summary
Здесь мы представляем Роман применение аортального кольца assay где prelabelled Мезенхимальные клетки совместно культивируемых с крыса аорто производные эндотелиальной сетями. Этот новый метод позволяет визуализация самонаведения мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и интеграцию с эндотелиальной сетями, количественная оценка свойств сети и оценки иммунофенотипа и генной экспрессии MSC.
Abstract
Ангиогенез-это комплекс, жестко регулируемых процесс, ответственный за обеспечение и поддержание адекватного ткани перфузии. Обслуживания недостаточно сосудистую и патологических уродств может привести к тяжелой ишемической болезни, в то время как чрезмерно обильные сосудистой развитие связано с рак и воспалительные заболевания. Перспективной формой pro ангиогенных терапии является использование ангиогенных клеток источников, которые могут обеспечить регуляторные факторы, а также физической поддержки для новых развивающихся сосудистую.
Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются широко исследованы кандидатами для сосудистой регенерации из-за их паракринными эффекты и их способность обнаруживать и домом для ишемического или воспаленных тканей. В частности первый триместр человеческой пуповинной периваскулярной клетки (FTM HUCPVCs) являются весьма перспективный кандидат из-за их перицит как свойства, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и надежные паракринными профиль. Чтобы эффективно оценить потенциально ангиогенных регенерации клеток, это условие, чтобы проверить их в надежных и «перевода» предварительно клинических анализов. Assay аортального кольца является ex vivo ангиогенеза модель, которая позволяет легко количественная оценка эндотелиальной трубчатых структур, обеспечивает аксессуар поддержки клетки и внеклеточного матрикса (ECM) от хоста, исключает воспалительного компонентов и является быстрый и недорогой для установки. Это выгодно, когда по сравнению с моделями в естественных условиях (например, роговицы пробирного, Matrigel вилка пробирного); assay аортального кольца можно отслеживать управляемых клетки и наблюдать межклеточных взаимодействий избегая xeno иммунной неприятие.
Мы представляем протокол для Роман применение assay аортального кольца, которая включает в себя человека MSCs в совместное культур с развивающимися крыса аорты эндотелиальной сетями. Этот assay позволяет для анализа вклада MSC в трубку формирования и развития посредством физических взаимодействий перицит как и их потенции для активно мигрируют на сайты по ангиогенез и для оценки их способности выполнять и посредником ECM обработки. Этот протокол обеспечивает дополнительную информацию об изменениях в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры.
Introduction
Сложный процесс ангиогенеза улучшает и поддерживает перфузии тканей путем содействия развитию новой крови судна из существующих сосудистую1. Это жестко регулируется, сбалансированный процесс про ангиогенных и анти ангиогенными факторами. Любой недостаток в этой системе может привести к недостаточной судно обслуживания или роста, вызывая тяжелые ишемического заболевания, включая болезни миокарда, инсульта и нейродегенеративных расстройств. Однако преувеличенные сосудистой развития характерно для условий, включая рак и воспалительные заболевания2.
Ключевое значение имеет разработка методов лечения, которые направлены на контроль ангиогенеза для достижения благоприятного регенерацию. Несмотря на обширные доклинических и клинических исследований попытки стимулировать ангиогенеза, с помощью про ангиогенных факторов и микроРНК не смогли достичь желаемых результатов3,4,5. Возможные причины для переходных эффектов: ограниченное долголетия ангиогенных белков и нуклеиновых кислот, и конечное число целевых факторов роста6,7. Хотя растворимые ангиогенных факторов необходимы для инициирования ангиогенеза, содержание и функциональность сосудистую зависят от поддержки типов клеток, включая pericytes и гладкомышечные клетки8. Поле pro ангиогенных терапии в настоящее время изучает потенциальные источники стволовых клеток и прародитель клеток, которые могут предоставить ангиогенных факторов на местном уровне, хотя физически поддерживать недавно разработали сосудистую, самостоятельного обновления или даже дифференциации в 9,клетки эндотелия как10. Нахождение оптимального ангиогенных типы клеток с возможностью выполнять эти функциональные требования открывает большие перспективы для регенерации ишемии тканей.
Для того, чтобы успешно воплотить потенциальные терапии на основе ячеек в клинических испытаниях, доклинические исследования должны продемонстрировать их эффективность и выделить основные механизмы ангиогенных. Несмотря на большое количество установленных ангиогенеза анализов, поле не хватает «золотой стандарт» в vitro assay, который может достоверно оценить эффективность потенциального кандидата ячейка типы11,12, 13. Большинство в vitro ангиогенеза анализы (в том числе эндотелиальной анализов формирования распространения, миграции и трубки) обычно оценить влияние клеток или соединений на эндотелиальных клеток фенотипические изменения или различия в трубчатые и сетевых структур14,15. Хотя эти особенности важны по ангиогенез, «переводимые» Пробирная следует также оценить: 1) увеличения или замена вспомогательных типов клеток, включая pericytes или гладких мышечных клеток, 2) обработка ECM и/или базальной мембраны, и 3). эффективность для поощрения формирования функциональных microvasculature. В естественных условиях ангиогенез моделей, включая роговицы пробирного и Matrigel вилка assay, пилки микроокружения уникальный в естественных условиях , но оспариваются трудности отслеживания управляемых клеток соблюдать физических взаимодействий. Кроме того в в естественных условиях модели, xeno иммунной отказа может произойти во время тестирования кандидатов терапии потенциальных аллогенных клеток16. Ex vivo модели ангиогенеза, особенно аортального кольца assay может обеспечить: 1) легко наблюдения и количественная оценка трубчатых структур, 2) аксессуар поддержки клетки, 3) ECM от принимающей страны и искусственные материалы, 4) исключения воспалительных компоненты и 5) быстрый и недорогой установки17,18. Как правило пробирного аортального кольца можно протестировать ангиогенных потенциал малых выделительные протеины, фармакологических агентов и трансгенных грызунов модели19,,2021.
MSCs являются перспективными кандидатами для сосудистой регенерации главным образом через их паракринными опосредованной эффекты22,,2324. Было показано, что MSCs выделяют ключевые ангиогенных факторов, включая Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактора роста гепатоцитов (HGF), инсулина подобный фактор роста-1 (ИФР-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и angiopoeitin-1 (анг-1)25 ,26. MSCs может также обнаружить и ишемического или воспаленные ткани, однако, точные механизмы находятся в стадии расследования. Все больше литературы поддерживает гипотезу о том, что большинство MSCs возникают из клеток периваскулярной, совместно Экспресс перицит маркеры и могут вести себя как pericytes27. HUCPVCs являются источником молодой MSCs, производный от региона периваскулярной человека пуповины. Они представляют собой население MSCs с перицит как свойства и характеризовались из пуповины FTM и срок. FTM HUCPVCs демонстрируют высокое выражение перицит маркеров, включая CD146 и NG2, Высокий пролиферативный и мультилинейного потенциал, иммунной привилегированный свойства и отображать надежный паракринными профиль28. FTM HUCPVCs являются тип ячейки идеальным кандидатом для содействия восстановлению пораженных тканей путем поощрения новой сосудистую через их свойства перицит как.
Чтобы проверить ангиогенных потенциал и перицит как свойства человека MSCs, очень ограниченное количество анализов по ангиогенез, где положительные angiotropic миграции (в дальнейшем именуемый «самонаведения»), ECM обработки и развитие физической взаимодействий между типами клеток могут быть исследованы, во время получения количественных данных о microvasculature развитии.
Настоящим мы представляем протокол, который описывает Роман применение assay аортального кольца. Человека MSCs были совместно культивируемых с развивающимися крыса производные аорты эндотелиальных сетями, оценить их вклад в формирование, созревания и гомеостаза. Эта версия аортального кольца assay оценивает способности и потенции кандидатов терапии клетки Главная сайты по ангиогенез, выполнять и посредником ECM обработки и вносить эндотелиальной трубчатых развития путем установления перицит как физической взаимодействий. Помимо количественного чистый эффект MSCs на в vitro формирование эндотелиальной сети и наблюдения межклеточных взаимодействий, мы также оптимизирован протокол изолировать MSCs от совместного культур. Выполняя проточной цитометрии и ПЦР, это можно охарактеризовать изменения в MSC фенотипа и ген выражение после совместного культуры. Как модель типов клеток мы сравнили онтогенетически рано (дородовой) и поздний (взрослый) источники человека MSCs: FTM HUCPVCs и человека МСК костного мозга-производных (BMSC), соответственно, в assay аортального кольца. Мы предлагаем, что аортального кольца assay может использоваться для изучения ангиогенных потенциал любой физически поддержки типа ячейки, когда расследуется ангиогенных регенеративной приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько критических этапов в создании успешных аортального кольца пробирного MSC Сопредседатель культуры эксперимент. Во-первых, являются наиболее важных шагов при изоляции и секционирование аорты: 1) получения исключительно сегмента грудной аорты; 2) тщательно устранения…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы поблагодарить следующих сотрудников и исследования персонала: Andrée Готье-Фишер, Мэтью Librach, Таня Барретто, Tharsan Velauthapillai и Сара Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
