O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro
Summary
Aqui, apresentamos uma aplicação nova do ensaio do anel aórtico onde prelabelled as células mesenquimais são co cultivadas com redes endotelial derivado de aorta de ratos. Este novo método permite a visualização de células estromais mesenquimais (MSCs) homing e integração com redes endoteliais, quantificação das propriedades de rede e avaliação de expressão de gene e immunophenotypes MSC.
Abstract
Angiogênese é um processo complexo, altamente regulamentado, responsável pela criação e manutenção de perfusão do tecido adequado. Manutenção de vascularização insuficiente e malformações patológicas podem resultar em graves doenças isquêmicas, enquanto excessivamente abundante desenvolvimento vascular está associado com câncer e doenças inflamatórias. Uma forma promissora de pro-angiogênico terapia é a utilização de fontes de célula angiogênico, que podem fornecer fatores regulatórios, bem como suporte físico para o desenvolvimento de recém vasculatura.
Células estromais mesenquimais (MSCs) são candidatos extensivamente investigados para regeneração vascular devido a seus efeitos parácrina e sua capacidade para detectar e lar de tecidos isquêmicos ou inflamados. Em particular, primeiro trimestre humana cordão umbilical perivasculares células (FTM HUCPVCs) são um candidato altamente promissor devido a suas propriedades como Pericito, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e parácrina robusta o seu perfil. Para efetivamente avaliar potencialmente angiogênico células regenerativas, é um requisito para testá-los em confiável e ensaios pré-clínicos “traduzíveis”. O ensaio do anel aórtico é um ex vivo modelo de angiogênese que permite a fácil quantificação de estruturas tubulares endoteliais, fornece acessórias apoia células e matriz extracelular (ECM) do host, exclui componentes inflamatórios e é rápida e barata para configurar. Isto é vantajoso em relação na vivo modelos (por exemplo, ensaio da córnea, Matrigel ficha de ensaio); o ensaio do anel aórtico pode rastrear as células administradas e observar interações intercelulares, evitando a rejeição de xeno-imune.
Apresentamos um protocolo para um aplicativo de romance do ensaio do anel da aorta, que inclui a humanas MSCs em culturas co com desenvolvimento rato aórtica endotelial das redes. Este ensaio permite a análise da contribuição da MSC para tubo de formação e desenvolvimento através de interações físicas como Pericito e de sua potência para ativamente migrando para sites da angiogênese e para avaliar sua capacidade de realizar e mediar Processamento de ECM. Este protocolo fornece mais informações sobre as alterações na expressão de gene e fenótipo MSC seguinte co-cultura.
Introduction
O complexo processo de angiogênese melhora e mantém a perfusão do tecido, promovendo o desenvolvimento de embarcação de sangue novo de pré-existente vasculatura1. É um processo rigidamente regulamentado, equilibrado por fatores pro-angiogênico e antiangiogênico. Qualquer deficiência neste sistema pode conduzir a embarcação insuficiente manutenção ou crescimento, causando graves doenças isquêmicas, incluindo doença do miocárdio, acidente vascular cerebral e doenças neurodegenerativas. No entanto, exagerado desenvolvimento vascular é característica para as condições, incluindo câncer e doenças inflamatórias2.
Desenvolvimento de terapias que visam controlar a angiogênese para alcançar a regeneração tecidual favorável é de primordial importância. Apesar de extensas investigações pré-clínicos e clínicas, tentativas de estimular a angiogênese usando microRNAs e fatores de pro-angiogênico conseguiram alcançar os resultados desejados3,4,5. Possíveis razões para os efeitos transitórios incluem: longevidade limitada de angiogênico proteínas e ácidos nucleicos e o número finito de alvo de fatores de crescimento6,7. Embora fatores solúveis angiogênico são essenciais para dar início a angiogênese, a manutenção e a funcionalidade da vasculatura dependem de suporte a tipos de células, incluindo células de pericitos e músculo liso8. O campo de pro-angiogênico terapias agora é explorar potenciais células-tronco progenitoras célula fontes e que podem fornecer fatores angiogênico localmente, enquanto fisicamente apoiando recém desenvolvido vasculatura, auto renovação ou até mesmo diferenciar em células endoteliais9,10. Encontrar o ideal angiogênico tipos de células com a capacidade de cumprir estes requisitos funcionais detém uma grande promessa para a regeneração do tecido isquêmico.
Para traduzir com sucesso potenciais terapias baseadas em células em ensaios clínicos, estudos pré-clínicos precisam demonstrar sua eficácia e destacar os mecanismos subjacentes de angiogênico. Apesar do elevado número de ensaios de angiogênese estabelecida, o campo carece de um “padrão-ouro” em vitro ensaio que confiantemente poderia avaliar a eficácia do potencial candidato célula tipos11,12, 13. maioria em vitro angiogênese ensaios (incluindo os ensaios de formação de proliferação, migração e tubo endoteliais) normalmente avaliar os efeitos de células ou de compostos em mudanças fenotípica ou diferenciação em células endoteliais tubular e rede de estruturas de14,15. Enquanto estes recursos são essenciais para a angiogênese, um ensaio “traduzível” também deve avaliar: 1) o aumento ou substituição do suporte tipos de células, incluindo pericitos ou células musculares lisas, 2) o processamento de ECM e/ou membrana basal, e 3). a eficiência para promover a formação de microvasculatura funcional. Na vivo angiogênese modelos, incluindo o ensaio da córnea e Matrigel plug ensaio, recapitular o microambiente exclusivo na vivo mas são desafiados pela dificuldade de rastreamento administrado células para observar interações físicas. Além disso, em modelos na vivo , xeno-imune rejeição pode ocorrer ao testar potenciais alogênico terapia candidatos16. Ex vivo angiogênese modelos, particularmente o ensaio do anel aórtico pode fornecer: 1) fácil observação e quantificação de estruturas tubulares, células de apoia 2) acessórias, 3) ECM de host e fontes artificiais, 4) exclusão de inflamatória componentes e 5) instalação rápida e barata de17,18. Normalmente, o ensaio do anel aórtico pode testar o potencial angiogênico de pequenas proteínas secretoras, agentes farmacológicos e modelos de roedores transgênicos19,20,21.
MSCs são candidatos promissores para regeneração vascular, principalmente através de seus efeitos mediados por parácrina22,23,24. MSCs foram mostrados para secretar fatores chave angiogênico incluindo o fator de crescimento endotelial Vascular (VEGF), fator de crescimento de hepatócito (HGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento do fibroblasto (bFGF) básica e angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. Também podem detectar o MSCs e tecidos lar de isquêmico ou inflamadas, no entanto, os mecanismos exatos estão ainda sob investigação. Cada vez mais, a literatura suporta a hipótese de que a maioria MSCs surgem de células perivasculares, co expressam Pericito marcadores e podem comportar-se como pericitos27. HUCPVCs são uma fonte jovem de MSCs derivado da região perivascular do cordão umbilical humano. Eles representam uma população de MSCs com propriedades como Pericito e foram caracterizados de ambos FTM e termo de cordões umbilicais. FTM HUCPVCs demonstram uma alta expressão de marcadores Pericito incluindo CD146 e NG2, alto potencial proliferativo e multilineage, Propriedades imune privilégios e exibir um parácrina robusto perfil28. FTM HUCPVCs são um tipo de célula do candidato ideal para promover a regeneração do tecido lesado através da promoção de Nova vasculatura através de suas propriedades como Pericito.
Para testar o potencial angiogênico e Pericito, como propriedades de MSCs humanas, um número muito limitado de angiogênese ensaios está disponíveis onde positivo angiotropic migração (doravante referida como “homing”), ECM processamento e desenvolvimento da física interações entre tipos de células podem ser investigadas, enquanto a obtenção de dados quantitativos sobre o desenvolvimento da microvasculatura.
Temos a honra de apresentar um protocolo que descreve um novo aplicativo do ensaio do anel aórtico. MSCs humanas foram co cultivadas com desenvolvimento rato-derivado da aorta endotelial das redes para avaliar a sua contribuição para a formação, maturação e homeostase de tubo. Esta versão do ensaio do anel aórtico avalia a capacidade e a potência dos candidatos à terapia celular para casa para sites da angiogênese, realizar e mediar o processamento de ECM, e contribuir para endotelial desenvolvimento tubular através de estabelecer como Pericito física interações. Além de quantificar o efeito líquido de MSCs na formação de rede endotelial em vitro e observando interações intercelulares, nós também Aperfeiçoamos um protocolo para isolar MSCs de culturas co. Realizando qPCR e citometria de fluxo, é possível caracterizar mudanças na expressão de gene e fenótipo MSC co-cultura a seguir. Como tipos de células do modelo, comparamos ontogenetically cedo (pré-natal) e finais (adultas) fontes de MSCs humanos: HUCPVCs FTM e humano derivadas da medula óssea MSCs (BMSC), respectivamente, no ensaio de anel aórtico. Propomos que o ensaio do anel da aorta pode ser usado para estudar o potencial angiogênico de qualquer tipo de célula fisicamente apoio quando sob investigação por aplicações regenerativa angiogênico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários estágios críticos na criação de um ensaio de anel aórtico bem sucedida experiência de co-cultura MSC. Primeiro, os passos mais importantes quando isolando e aorta de corte são: 1) obtenção exclusivamente o segmento torácico da aorta; 2) cuidadosamente removendo a ramificação dos vasos sanguíneos, o conjuntivo e o tecido adiposo e; 3) seções até corte da aorta (~ 1mm) para limitar a variabilidade entre cada ensaio. Em segundo lugar, a incorporação de sucesso dos anéis da aorta em BME é …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer aos seguintes membros funcionários e pessoal de pesquisa: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
