Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Siyanobakteriler, fotosentez yoluyla ışığa sabitlenmiş CO _2'den gelen karbonun başlıca karbonhidrat deposu olarak glikojen biriktirir. Glikojen, α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantıları ile yaratılan dalları olan doğrusal α-1,4-bağlı glukandan oluşan bir glıkan. Siyanobakterlerdeki glikojen biyosentezi, fosfoglukomütaz ve ADP-glikoz pirofosforilazın ardışık eylemi yoluyla glikoz-6-fosfatın ADP-glükoza dönüştürülmesiyle başlar. ADP-glikozdaki glukoz kısmı, bir veya daha fazla glikojen sentezleyicisi (GlgA) ile glikojen α-1,4-glukan omurgasının indirgeyici olmayan ucuna aktarılır. Daha sonra, dallanmış bir enzim, glikojen parçacığını üretmek için daha da genişletilen α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantısını getirir. Karanlıkta, glikojen, glikojen fosforilaz, glikojen debranjivasyon enzimleri, α-glukanotransferaz ve malto-dekstrin fosforilazın fosforile glikoza ve serbest glikoza indirgenmesi ile parçalanır. Bu besleme intOksidatif pentoz fosfat yolu, Embden-Meyerhof-Parnas yolu (glikoliz) ve Entner-Doudoroff yolu ^{1 , 2 , 3 , 4} de dahil olmak üzere katabolik yolaklar.

Siyanobakterlerdeki glikojen metabolizması, son yıllarda cyanobacteria'nın, kimyasallar ve yakıtlar üretmek için güneş ışığı altında çalışan mikrobiyal hücre fabrikalarına dönüşmesi potansiyelinden dolayı artan bir ilgi topladı. Glikojen metabolizması, ürünlerin verimini artıracak şekilde modifiye edilebilir, çünkü glikojen bu bakterilerdeki en büyük esnek karbon havuzudur. Bunun bir örneği siyanobakteriyum Synechococcus sp. Mannitol üretmek için genetik olarak tasarlanmış PCC 7002; glikojen sentezinin genetik bozulma manitol verimi, 3-kat ⁵ artar. Bir başka örnek, biyoetanolün glikojen yüklü vahşi türevlerindenYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Vahşi hücre glikojen içeriği azot açlığı sırasında hücrenin kuru ağırlığının% 60'ına kadar olabilir ⁶ .

Glikojen metabolizması ve düzenlenmesi konusundaki anlayışımız son yıllarda da genişlemiştir. Glikojenin ışığa birikmesi ve karanlıkta katabolize olması bilinmesine rağmen, diel döngüsü boyunca glikojen metabolizmasının ayrıntılı kinetiği, Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Dahası, glikojen birikimini etkileyen birkaç gen tespit edilmiştir. Dikkate değer bir örnek, varsayılan histidin kinaz PmgA'nın ve kodlamayan RNA PmgRl'in bir düzenleyici kaskad oluşturması ve glikojenin birikimini kontrol ettiği bulgudur. İlginç olarak, pmgA ve pmgR1 silme mutantları, Synechocystis sp. ' Un vahşi türü suşu kadar iki kat daha fazla glikojen birikir. PCC 68038 ^{, 9} . Diğer düzenleyici elementlerin alternatif sigma faktörü E ve transkripsiyon faktörü CyAbrB2 ^{10 , 11} de dahil olmak üzere glikojenin birikimini etkilediği bilinmektedir.

Glikojen düzenlenmesi ve metabolizması ilgi arttıkça, glikojen içeriğinin tayinini açıklayan ayrıntılı bir protokol gereklidir. Literatürde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Asit hidrolizi, ardından yüksek basınçlı anyon değişimli sıvı kromatografisi ile monosakkarit içeriğinin saptanması, ardından atımlı amperometrik bir detektör veya asit ve fenille yapılan muameleler sonrası spektrometrik tayin ^{, 9 , 10 , 12 , 13} glikojen içeriğini yaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, yüksek basınçlı bir anyon değişimi sıvı kromatografisiC enstrümanı çok pahalıdır ve bazı siyanobakteriyel türlerde biriken bilinen sukroz ¹⁴ , glikosilgliserol ¹⁵ ve selüloz ^{16 , 17 , 18} gibi diğer glikoz içeren glikon konjugatlardan türetilen glikojeden türetilmiş glikozu ayırt etmez. Asit-fenol yöntemi, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, oldukça toksik reaktifler kullanır ve farklı gliko-konjügatlardan türeyen glikozu ayırt etmediği gibi glikoziti, glikolipidleri, lipopolisakaridleri ve hücre dışı matrisleri ¹² gibi hücresel malzemeleri oluşturan diğer monosakaritlerden ayırt etmez. Özellikle, sıcak asit-fenol testi, glikoz içeriğinin spesifik belirlenmesi için değil, toplam karbonhidrat içeriğinin saptanması için sıklıkla kullanılır ¹² . Enzimatik hyA-amiloglukozidaz ile glikozun glikoza droizlenmesi ve ardından bir enzim-eşlemeli analiz yoluyla glikozun saptanması, glıkojenden türetilmiş glukoza karşı oldukça hassas ve spesifik bir kolorimetrik okuma üretir. Özgüllük, hücre lizatlarından glikojenin etanol ^{5 , 8 , 19} tarafından tercihli olarak çökeltilmesi ile daha da geliştirilebilir.

Burada, en yaygın olarak incelenen iki siyanobakteriyal türün, Synechocystis sp. ' Deki glikojen içeriğinin enzim bazlı tahlili için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, yabani tip ve mutant suşlarda. Etkin hidrolizi sağlamak için, α-amilaz ve α-amiloglükosidaz'dan oluşan bir kokteyl kullanılır ⁸ . Endo-etkili α-amilaz, çeşitli glukanlardaki α-1,4-bağlarını dekstrinlere hidrolize eder; bunlar, daha da hidrolize edilirler.O glukozun ekzo-etki eden α-amiloglükosidaz ^{20 ile} sentezlenmesi. Bu enzimlerin sinerjistik etkileri çok iyi bilinmektedir ve bu enzimler, bitki biyokütle ^21'inde selüloz gibi diğer glikoconjugantları etkilemeden glikojen gibi α'ya bağlı glukan olan nişastanın seçici hidrolizinde rutin olarak kullanılır. Serbest bırakılan glikoz, oksijenin hidrojen peroksite indirgenmesini katalize eden glikoz oksidaz ve glükozun bir laktona yükseltgenmesini katalizleyen bir enzim eşlenimli tahlilden sonra niceliksel olarak tespit edilir – ve peroksidaz hidrojen peroksitten pembe renkli bir kinonimin boyası üretir, Bir fenolik bileşik ve 4-aminoantipirin ^{22'yi içerir} .