קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO ₂ קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן מחולק על ידי גליקוגן phosphorylase, אנזים גליקוגן זיוף, α-glucanotransferase, ו- malto-dextrin phosphorylase לתוך גלוקוז phosphorylated גלוקוז חינם. הזנות אלה intO מסלולים קטבוליים, כולל מסלול פוספט חמצון, מסלול Embeden-Meyerhof-Parnas (glycolysis), ואת מסלול Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

מטבוליזם גליקוגן ב cyanobacteria יש צבר עניין הולך וגובר בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל של cyanobacteria להתפתח מפעלים תא חיידקים מונע על ידי אור השמש לייצר כימיקלים ודלקים. מטבוליזם גליקוגן יכול להיות שונה כדי להגדיל את התשואה של המוצרים, כי הגליקוגן הוא מאגר פחמן גמיש הגדול ביותר בחיידקים אלה. דוגמה לכך היא cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, אשר כבר מהונדסים גנטית לייצר mannitol; הפרעה גנטית של סינתזת הגליקוגן מגדיל את התשואה מניטול 3 פי ⁵ . דוגמה נוספת היא ייצור של ביואתנול מ-גליקוגן נטען wildtYe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . תוכן גליקוגן תא wildtype עשוי להיות עד 60% מהמשקל היבש של התא במהלך רעב חנקן ^6.

ההבנה שלנו של מטבוליזם גליקוגן ורגולציה התרחבה גם בשנים האחרונות. בעוד גליקוגן ידוע לצבור באור להיות catabolized בחושך, קינטיקה מפורטת של מטבוליזם הגליקוגן במהלך מחזור דיל היה רק ​​לאחרונה התגלה Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . יתר על כן, כמה גנים המשפיעים על הצטברות של גליקוגן זוהו. דוגמה בולטת היא התגלית כי pingA histidine histidine ואת הלא קידוד RNA PmgR1 טופס אשד פיקוח ולשלוט על הצטברות של גליקוגן. מעניין, את pmgA ו pmgR1 מחיקת מוטציות לצבור פעמיים כמו גליקוגן כמו זן wildtype של Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . אלמנטים רגולטוריים אחרים ידועים גם להשפיע על הצטברות של גליקוגן, כולל אלטרנטיבה גורם סיגמא E גורם תעתיק CyAbrB2 ^{10 , 11} .

כמו עניין גליקוגן הרגולציה ומטבוליזם לגדול, פרוטוקול מפורט המתאר את קביעת התוכן הגליקוגן הוא מוצדק. מספר שיטות משמשות בספרות. חומצה hydrolysis ואחריו קביעת התוכן monosaccharide באמצעות ניתוח בלחץ גבוה אניון כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם גלאי amperometric פעמו או קביעת ספקטרומטריים בעקבות טיפולים עם חומצה פנול נמצאים בשימוש נרחב שיטות כדי משוער תוכן הגליקוגן ^{9 , 10 , 12 , 13} . עם זאת, בלחץ גבוה אניון החלפת chromatographi נוזלימכשיר C הוא יקר מאוד ואינו להפלות גלוקוז נגזר גליקוגן מן הנגזר אחרים glycoconjugates המכילים גלוקוז, כגון סוכרוז ¹⁴ , glucosylglycerol ¹⁵ , תאית ^{16 , 17 , 18} , אשר ידועים לצבור כמה מינים cyanobacterial. השיטה חומצה פנול ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. עם זאת, הוא משתמש ריאגנטים רעילים מאוד אינו מבחין גלוקוז נגזר glycoconjugates שונים, וגם לא להבחין גלוקוז מ monosaccharides אחרים המהווים חומרים סלולריים, כגון גליקוליפידים, lipopolysaccharides, מטריצות תאיים ¹² . יש לציין כי חומצה חמה-פנול assay משמש לעתים קרובות לקביעת התוכן הכולל פחמימות ולא על הקביעה הספציפית של תוכן גלוקוז ¹² . אנזימטיתDrolysis של גליקוגן לגלוקוז על ידי α-amyloglucosidase ואחריו זיהוי של גלוקוז באמצעות assay אנזים מצמידים מייצר readout colorimetric כי הוא רגיש במיוחד ספציפיים גלוקוז נגזר גליקוגן. הספציפיות יכולה להיות משופרת נוספת עם משקעים מועדפים של גליקוגן מ lysates התא על ידי אתנול ^{5 , 8 , 19} .

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור assay מבוסס אנזים של תכולת הגליקוגן בשני מינים cyanobacterial הנחקרים ביותר, Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, ב wildtype ו זנים מוטציה. על מנת להבטיח הידרוליזה יעילה, קוקטייל של α-amylase ו α-amyloglucosidase משמש ⁸ . Endo משחק α-amylase hydrolyzes את α-1,4-linkages ב glucans שונים לתוך dextrins, אשר hydrolyzed נוספתO גלוקוז על ידי exo משחק α-amyloglucosidase ²⁰ . ההשפעות הסינרגיסטיות של אנזימים אלה ידועות היטב, ואנזימים אלה משמשים באופן שגרתי להידרוליזה סלקטיבית של עמילן, שהוא גלוקן מקושר ל- α כמו גליקוגן, מבלי להשפיע על גליקוקונג'נטים אחרים, כגון תאית, ביומסה הצמחית ²¹ . גלוקוז משוחרר מזוהה כמותית לאחר assay אנזים מצמידים המורכב oxidase גלוקוז, אשר מזרז את הפחתת חמצן מי חמצן ואת חמצון של גלוקוז ל lactone ו peroxidase, אשר מייצרת צבע quinoneimine בצבע ורוד מי חמצן, תרכובת פנולית, ו- 4-aminoantipyrine ²² .