シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定
Summary
ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。
Abstract
シアノバクテリアは、光合成の間に主要な細胞内炭素およびエネルギー貯蔵としてグリコーゲンを蓄積する。最近の研究の進展により、生合成と異化のディールサイクル、レドックス調節、非コードRNAの関与を含む、グリコーゲン代謝の複雑なメカニズムが明らかになった。同時に、産物収量を増強するために、遺伝子操作されたシアノバクテリア中のグリコーゲンから望ましい産物に炭素をリダイレクトする努力がなされている。さまざまな精度と技術的な複雑さを伴い、シアノバクテリアのグリコーゲン含量を決定するためにいくつかの方法が使用されています。ここでは、標準的なライフサイエンス研究室で行うことができるシアノバクテリアのグリコーゲン含量の信頼できる測定のための詳細なプロトコールを提供します。プロトコールは、細胞溶解物からのグリコーゲンの選択的沈殿およびグリコーゲンの酵素的解重合によってグルコース単量体を生成し、これはグルコースオキシidase-peroxidase（GOD-POD）酵素結合アッセイを用いて測定した。この方法は、 Synechocystis sp。 PCC 6803およびSynechococcus sp。代謝工学で広く使用されている2つのモデルのシアノバクテリア種、PCC 7002。さらに、該方法は、野生型と調節エレメントまたはグリコーゲン生合成遺伝子に欠損を有する変異体との間のグリコーゲン含量の差異を首尾よく示した。
Introduction
シアノバクテリアは、光合成により光に固定されたCO 2から炭素の主要な炭水化物貯蔵物としてグリコーゲンを蓄積する。グリコーゲンは、α-1,6-結合グルコシル結合によってつくられる分枝を有する線状α-1,4-結合グルカンからなるグリカンである。シアノバクテリアにおけるグリコーゲン生合成は、ホスホグルコムターゼおよびADP-グルコースピロホスホリラーゼの連続作用によるグルコース-6-リン酸のADP-グルコースへの変換から始まる。 ADP-グルコース中のグルコース部分は、1種以上のグリコーゲンシンターゼ（GlgA）によってグリコーゲンのα-1,4-グルカン主鎖の非還元末端に転移される。続いて、分枝酵素はα-1,6-結合グルコシル結合を導入し、これはさらに伸長してグリコーゲン粒子を生成する。暗所では、グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ、グリコーゲン脱分岐酵素、α-グルカノトランスフェラーゼ、およびマルトデキストリンホスホリラーゼによってリン酸化されたグルコースおよび遊離グルコースに分解される。これらのフィードintO酸化的ペントースリン酸経路、エムデン-マイヤーホフ-パルナス経路（解糖）、およびエントナー・ドゥドロフ経路1、2、3、4を含む異化経路、。
シアノバクテリアのグリコーゲン代謝は、シアノバクテリアが日光によって駆動される微生物細胞工場に発展して化学物質や燃料を生産する可能性があるため、近年注目を集めています。グリコーゲン代謝は、グリコーゲンがこれらの細菌における最大の柔軟な炭素プールであるため、生成物の収量を増加させるように改変することができる。一例はシアノバクテリウム・シネココッカス sp。マンニトールを生産するように遺伝子操作されたPCC7002;グリコーゲン合成の遺伝的破壊はマンニトール収率を3倍に増加させる5 。別の例は、グリコーゲン負荷野生動物からのバイオエタノールの生産であるSynechococcus sp。 PCC 7002 6 。野生型細胞のグリコーゲン含有量は、窒素飢餓6中の細胞の乾燥重量の60％までとすることができます。
グリコーゲンの代謝および調節に関する我々の理解も近年拡大している。グリコーゲンは、光の中に蓄積し、暗所で異化されることが知られているが、ディールサイクル中のグリコーゲン代謝の詳細な動態は、 Synechocystis sp。 PCC 6803 7 。さらに、グリコーゲンの蓄積に影響を及ぼすいくつかの遺伝子が同定されている。顕著な例は、推定ヒスチジンキナーゼPmgAおよび非コードRNA PmgR1が調節カスケードを形成し、グリコーゲンの蓄積を制御するという発見である。興味深いことに、 pmgAおよびpmgR1欠失突然変異体は、 シネコシスティス spの野生型株の2倍のグリコーゲンを蓄積する。 PCC 68038、9。他の調節エレメントは、代替シグマ因子Eおよび転写因子CyAbrB2 10、11を含め、グリコーゲンの蓄積に影響を与えることが知られています。
グリコーゲン調節および代謝に関心が高まるにつれて、グリコーゲン含量の決定を記述する詳細なプロトコルが正当化される。いくつかの方法が文献で使用されている。パルスアンペロメトリック検出器または酸とフェノールと処置後分析決意に結合された高圧陰イオン交換液体クロマトグラフィーを介して単糖類含有量の決意に続く酸加水分解が広くグリコーゲン含量9、10、12、13を近似する方法を使用しています。しかしながら、高圧アニオン交換液体クロマトグラフィーC機器は非常に高価であり、いくつかのシアノバクテリア種中に蓄積することが知られているようなスクロース14、グルコ15、及びセルロース16、17、18のような他のグルコース含有複合糖質、に由来するものからグリコーゲン由来のグルコースを区別しません。酸 – フェノール法は、標準的な実験装置を用いて行うことができる。しかし、毒性の高い試薬を使用し、異なる複合糖質由来のグルコースを区別しておらず、そのような糖脂質、リポ多糖、および外マトリックス12などの細胞材料を構成する他の単糖からグルコースを区別しません。特に、熱い酸 – フェノールアッセイは、グルコース含量の特定の決定12ではなく、総炭水化物含量の決定にしばしば用いられる。酵素的ハイα-アミログルコシダーゼによるグリコーゲンのグルコースへのグルコースの加水分解、その後の酵素結合アッセイによるグルコースの検出は、グリコーゲン由来のグルコースに対して非常に感受性が高く特異的な比色測定値を生成する。特異性は、エタノール5、8、19によって細胞溶解物からのグリコーゲンの優先析出をさらに向上させることができます。
ここでは、最も広く研究されている2つのシアノバクテリア種であるSynechocystis sp。のグリコーゲン含量の酵素ベースのアッセイの詳細なプロトコールについて説明します。 PCC 6803およびSynechococcus sp。 PCC7002を野生型株および変異株に導入した。効率的な加水分解を確実にするために、α-アミラーゼおよびα-アミログルコシダーゼのカクテルを使用する8 。エンド作用性α-アミラーゼは、種々のグルカン中のα-1,4-結合を加水分解してデキストリンとし、さらに加水分解しexo-actingα-アミログルコシダーゼ20によってグルコースを分解する。これらの酵素の相乗効果は周知であり、これらの酵素は、植物バイオマス21中のセルロースなどの他の糖質結合剤に影響を及ぼすことなく、α結合グルカン様グリコーゲンであるデンプンの選択的加水分解に日常的に使用されている。放出されたグルコースは、酸素の過酸化水素への還元およびグルコースのラクトンへの酸化を触媒するグルコースオキシダーゼおよび過酸化水素からピンク色のキノンイミン染料を生成するペルオキシダーゼからなる酵素結合アッセイに従って定量的に検出され、フェノール化合物、および4-アミノアンチピリン22 。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコル内の重要なステップは、グリコーゲン沈殿および再懸濁である。エタノール沈殿後の遠心分離後、グリコーゲンは、微量遠心管の壁に緩く付着する半透明ペレットを形成する。したがって、上清を除去する際には、ペレットを除去しないように注意する必要があります。グリコーゲンペレットは粘着性があり、乾燥すると可溶化が困難になります。グリコーゲンペレットの完全な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、デンマークのInnovationfonden Denmark（Pant Power、プロジェクト番号12-131844）、Villum Fonden（プロジェクト番号13363）のNordic Energy Research（AquaFEED、プロジェクト番号24）
Materials
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
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