Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries
Summary
Ici, nous présentons un dosage fiable et facile pour mesurer la teneur en glycogène dans les cellules cyanobactériennes. La procédure implique des précipitations, une dépolymérisation sélectionnable et la détection de résidus de glucose. Cette méthode est appropriée pour les souches de type sauvage et génétiquement modifiées et peut faciliter l'ingénierie métabolique des cyanobactéries.
Abstract
Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme stockage majeur de carbone et d'énergie intracellulaire pendant la photosynthèse. Les développements récents dans la recherche ont mis en évidence des mécanismes complexes du métabolisme du glycogène, y compris le cycle diels de la biosynthèse et du catabolisme, la régulation redox et l'implication de l'ARN non codant. Dans le même temps, des efforts sont faits pour rediriger le carbone du glycogène vers des produits désirables dans des cyanobactéries génétiquement modifiées pour améliorer les rendements des produits. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer le taux de glycogène dans les cyanobactéries, avec des précisions variables et des complexités techniques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la détermination fiable de la teneur en glycogène dans les cyanobactéries qui peuvent être effectuées dans un laboratoire de sciences de la vie standard. Le protocole implique la précipitation sélective du glycogène à partir du lysat cellulaire et la dépolymérisation enzymatique du glycogène pour générer des monomères de glucose, qui sont détectés par un bœuf de glucoseIdase-peroxydase (GOD-POD) couplé à l'enzyme. La méthode a été appliquée à Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, deux types d'espèces de cyanobactéries largement utilisées dans l'ingénierie métabolique. En outre, la méthode a montré avec succès des différences dans les teneurs en glycogène entre le type sauvage et les mutants défectueux dans les éléments régulateurs ou les gènes de biosynthèse du glycogène.
Introduction
Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme principal stock de glucides provenant du CO 2 fixé à la lumière par la photosynthèse. Le glycogène est un glycan consistant en un glucane linéaire α-1,4-lié avec des branches créées par des liaisons glucosyle liées à l'α-1,6. La biosynthèse du glycogène dans les cyanobactéries commence par la conversion du glucose-6-phosphate en ADP-glucose par l'action séquentielle de la phosphoglucomutase et de la pyrophosphorylase ADP-glucose. La fraction de glucose dans ADP-glucose est transférée à l'extrémité non réductrice du squelette α-1,4-glucane du glycogène par une ou plusieurs glycogènes synthases (GlgA). Par la suite, des enzymes de ramification introduisent la liaison glucosyle liée à l'α-1,6, qui est encore étendue pour générer la particule de glycogène. Dans le noir, le glycogène est décomposé par la glycogène phosphorylase, les enzymes débranchantes du glycogène, l'α-glucanotransférase et la malto-dextrine phosphorylase dans le glucose phosphorylé et le glucose libre. Ces flux intLes voies cataboliques, y compris la voie de phosphate de pentose oxydante, la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) et la voie de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .
Le métabolisme du glycogène dans les cyanobactéries a suscité un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de la possibilité que les cyanobactéries se développent dans des usines de cellules microbiennes entraînées par la lumière du soleil pour produire des produits chimiques et des combustibles. Le métabolisme du glycogène pourrait être modifié pour augmenter le rendement des produits, car le glycogène est le plus grand pool de carbone flexible de ces bactéries. Un exemple est la cyanobactérie Synechococcus sp. PCC 7002, qui a été génétiquement conçu pour produire du mannitol; La rupture génétique de la synthèse du glycogène augmente le rendement en mannit 3 fois 5 . Un autre exemple est la production de bioéthanol à partir de cellules sauvages chargées de glycogèneYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . La teneur en glycogène des cellules de type sauvage peut représenter jusqu'à 60% du poids sec de la cellule pendant la famine par l'azote 6 .
Notre compréhension du métabolisme et de la régulation du glycogène a également été élargie ces dernières années. Alors que le glycogène est connu pour s'accumuler dans la lumière et être catabolisé dans l'obscurité, la cinétique détaillée du métabolisme du glycogène pendant le cycle diel n'a été révélée que récemment dans Synechocystis sp. PCC 6803 7 . En outre, plusieurs gènes affectant l'accumulation de glycogène ont été identifiés. Un exemple notable est la découverte que la putative histidine kinase PmgA et l'ARN non codant PmgR1 forment une cascade régulatrice et contrôlent l'accumulation de glycogène. Fait intéressant, les mutants de suppression de pmgA et pmgR1 accumulent deux fois plus de glycogène que la souche de type sauvage de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . D'autres éléments réglementaires sont également connus pour affecter l'accumulation de glycogène, y compris le facteur de sigma alternatif E et le facteur de transcription CyAbrB2 10 , 11 .
À mesure que l'intérêt pour la régulation du glycogène et le métabolisme augmente, un protocole détaillé décrivant la détermination de la teneur en glycogène est justifié. Plusieurs méthodes sont utilisées dans la littérature. L'hydrolyse acide suivie de la détermination de la teneur en monosaccharides par une chromatographie liquide à échange d'anions haute pression associée à un détecteur ampérométrique pulsé ou à une détermination spectrométrique après des traitements avec de l'acide et du phénol sont des méthodes largement utilisées pour rapprocher la teneur en glycogène 9 , 10 , 12 , 13 . Cependant, une chromatographie liquide à échange d'anions haute pressionL'instrument c est très coûteux et ne distingue pas le glucose dérivé du glycogène de celui dérivé d'autres glycoconjugués contenant du glucose, tels que le saccharose 14 , le glucosylglycérol 15 et la cellulose 16 , 17 , 18 , qui sont connus pour s'accumuler dans certaines espèces de cyanobactéries. La méthode acide-phénol peut être effectuée en utilisant des équipements de laboratoire standard. Cependant, il utilise des réactifs hautement toxiques et ne distingue pas le glucose dérivé de différents glycoconjugués, ni distingue le glucose des autres monosaccharides qui constituent des matériaux cellulaires tels que les glycolipides, les lipopolysaccharides et les matrices extracellulaires 12 . Notamment, le dosage acide acide-phénol est souvent utilisé pour la détermination de la teneur totale en glucides plutôt que pour la détermination spécifique de la teneur en glucose 12 . Enzymatic hyL'hydrolyse du glycogène en glucose par l'α-amyloglucosidase suivie de la détection du glucose par un dosage couplé à une enzyme génère une lecture colorimétrique hautement sensible et spécifique au glucose dérivé du glycogène. La spécificité peut être renforcée avec la précipitation préférentielle du glycogène à partir des lysats cellulaires par l'éthanol 5 , 8 , 19 .
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour un dosage enzymatique du contenu en glycogène dans deux des espèces de cyanobactéries les plus étudiées, Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, dans les souches de type sauvage et mutant. Afin d'assurer une hydrolyse efficace, un cocktail d'α-amylase et d'α-amyloglucosidase est utilisé 8 . L'α-amylase à effet endo hydrolyse les liaisons α-1,4 dans divers glucanes dans les dextrines, qui sont encore hydrolysées tO glucose par ex-action de l'α-amyloglucosidase 20 . Les effets synergiques de ces enzymes sont bien connus, et ces enzymes sont habituellement utilisées pour l'hydrolyse sélective de l'amidon, qui est un glucane glycogène tel que glycogène, sans affecter d'autres glycoconjugants, comme la cellulose, dans la biomasse végétale 21 . Le glucose libéré est détecté quantitativement suite à un essai couplé par une enzyme consistant en glucose oxydase – qui catalyse la réduction de l'oxygène au peroxyde d'hydrogène et l'oxydation du glucose à une lactone et à la peroxydase – qui produit un colorant de quinoneimine de couleur rose provenant du peroxyde d'hydrogène, Un composé phénolique et la 4-aminoantipyrine 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques dans le protocole sont la précipitation et la resuspension du glycogène. Après centrifugation suite à la précipitation de l'éthanol, le glycogène forme une pastille translucide qui adhère légèrement aux parois des tubes de microcentrifugeuse. Par conséquent, lors de l'élimination du surnageant, une attention particulière doit être accordée afin de ne pas enlever la pastille. La pastille de glycogène est collante, et la solubilisation peut être difficile si elle sèche. Note…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent Nordic Energy Research (AquaFEED, projet no 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projet n ° 12-131844) et Villum Fonden (projet n ° 13363)
Materials
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
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