マウス二次口蓋融合のライブイメージング

組織融合は、複数の臓器の発達において重要なステップです。口唇および口蓋の裂け目、脊髄二分脊椎および心臓の奇形などの主要なヒトの先天性欠損は、組織融合の欠陥^1に起因し得る。マウス二次口蓋融合は、広範囲の開発^2、3、4、組織融合を制御する細胞および分子機構を同定するために検討されています。マウスでは、二次性口蓋の発達は、E11.5付近で始まり、両側の上顎プロセスのそれぞれから二次口蓋棚の成育を開始する。口蓋棚の初期成長は、舌に沿って垂直方向に約E14.0まで起こり、その時点で口蓋は舌の上で水平に上昇する。内向きの成長は、2つの口蓋棚の上皮間の物理的接触をもたらし、正中線上皮を形成するE14.5でのal seam（MES）。間葉の合流を可能にするために、介入MESを二次口蓋棚の間から除去し、完全な融合した2次口蓋の発達をE15.5 ^3で行わなければならない。

共培養上皮MES細胞層が2つの別々の口蓋棚の間でどのように形成され、次に間葉の密集を達成するために除去されたかは、口蓋裂進展における中心的な問題であった。マウスの組織学的および電子顕微鏡（EM）研究、外植体培養研究、および機能的なマウス遺伝学的実験に基づいて、いくつかの基本的な細胞挙動がこの過程に関与している。各口蓋棚の内側縁上皮MEEから糸状仮足状突起は、共有単MES ^6,7にこれらの上皮細胞のインターカレーションに続く最初の接点^5,6を容易にします。結果として得られる共用MESの除去3つの非排他的メカニズムによって進展することが提案されている。組織学的観察およびバイタル染料でトレースエクスビボ系統を用いた初期の研究は、MESは、MES細胞の間葉移行（EMT）に上皮によって除去される可能性があります^8、9、しかしより最近、上皮細胞の遺伝系統のトレースがに関して不確実性を上げたことを示し口蓋棚間葉^10、11、12への上皮細胞の長期的な貢献。重要なアポトーシス細胞の数、および適切な口蓋融合を受けることができないいくつかの変異体ではその数の減少は、アポトーシスがMESの溶解^2、3の主要なドライバーになるかもしれないという考えにつながっています。最後に、進行性の時点での上皮標識および静的観察を含む研究に最初から基づいて、MES細胞^13、口鼻及び前後寸法¹¹に移行することを提案するが、このような動的な細胞の振る舞いが原因ライブ口蓋組織でそれらを観察することができないため、最初は未確認でした。最近、我々は、蛍光標識のマウス遺伝的方法と外植片の棚の共焦点ライブイメージングを組み合わせた新しいライブイメージング方法論を開発することによって、これらの挙動を直接観察することができた。

まず、口蓋融合中口蓋上皮細胞における動的細胞挙動を視覚化するために、我々はKeratin14-CREマウス^14、15とROSA26-mTmG ^{FLOXマウス}を交配することによって、上皮特異的レポーターマウスを生成しました。得られた胚の口蓋外植片培養の共焦点ライブイメージングは​​、以前に提案されたいくつかの細胞挙動を確認し、融合プロセス⁶における新規事象を同定した</。上皮細胞膜突出は、最初の細胞 – 細胞接触に先行し、続いて細胞の層間挿入および口腔内細胞の置換によって上皮収束に至った。注目すべきことに、我々はまた、その細胞押し出し、上皮恒常性に重要な役割を果たしていると報告プロセスを発見し、マウス二次口蓋融合^6、16を駆動する主要なメカニズムでした。このイメージング方法は、他のレポーターラインでも使用できます。我々は、融合プロセス中のアクチン細胞骨格の動態を調べるためにLifeact-mRFPrubyトランスジェニックマウス^17、18を利用^しました。他のレポーターもまた口蓋融合の他の特定の局面を観察するために使用することができ、この方法はイメージングの必要性および顕微鏡の利用可能性に応じてレーザー走査共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡に適合させることができる。ライブイメージングは​​、発達生物学において重要なアプローチとなりつつあります。 Parti白内障、頭蓋顔面の形態形成は複雑であり、顔に影響を与えるヒトの先天性欠損が一般的である。この共焦点ライブイメージング法は、ヒトの頭蓋顔面異常の起源だけでなく、基本的な発達メカニズムの基礎知識の改善を可能にする。