Живая визуализация мышей

Слияние тканей является важным шагом в развитии нескольких органов. Основные дефекты врожденного порока человека, такие как расщелина губы и неба, расщепление позвоночника и мальформации сердца, могут быть результатом дефектов в тканевом слиянии ¹ . Мышцы вторичного слияния неба широко изучались для идентификации клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих слияние тканей в развитии ^{2 , 3 , 4} . У мышей развитие вторичного неба начинается примерно в районе E11.5 с выростом вторичного небного шельфа от каждого из двусторонних верхнечелюстных процессов. Первоначальный рост небных полков происходит вертикально вдоль языка, до приблизительно E14.0, и в это время небные полки поднимаются горизонтально над языком. Медиально-направленный рост приводит к физическому контакту между прилегающим эпителием двух небных полочек, образуя эпителий средней линииАль-шва (МЧС) в Е14.5. Промежуточный МЭС должен быть удален из вторичных небных стеллажей, чтобы обеспечить мезенхимальное слияние и развитие неповрежденного, полностью слитого вторичного неба по E15.5 ³ .

Как общий слой эпителиальных клеток MES образуется между двумя отдельными небными полками, а затем удаляется для достижения мезенхимальной слияния, был основным вопросом развития неба. Основываясь на исследованиях гистологической и электронной микроскопии мыши (ЭМ), исследованиях культивирования эксплантатов и экспериментов по генетической генетике мыши, в этом процессе участвовали несколько фундаментальных типов клеток. Филоподийные проекции из медиального краевого эпителия MEE каждого небного шельфа облегчают начальный контакт ^{5 , 6} , а затем интеркаляцию этих эпителиальных клеток в общую единицу MES ^{6 , 7} . Удаление итоговой общей MESБыло предложено использовать три неэксклюзивных механизма. Ранние исследования с использованием гистологического наблюдения и трассировки линии ex vivo с использованием жизненно важных красителей показали, что МЭС может быть удалена эпителиальным путем к мезенхимному переходу (ЕМТ) клеток MES ^{8 , 9} , хотя в последнее время генетическое отслеживание линий эпителиальных клеток вызывает неопределенность в отношении Долгосрочный вклад эпителиальных клеток в меланиму небной полки ^{10 , 11 , 12} . Значительное количество апоптотических клеток и уменьшение их числа у некоторых мутантов, которые не проходят надлежащего слияния неба, привели к мысли, что апоптоз может быть основным фактором растворения МЭС ^{2 , 3} . Наконец, основываясь первоначально на исследованиях, связанных с эпителиальной маркировкой и статическим наблюдением в прогрессивные моменты времени, клетки MESБыли предложены мигрировать в орональном и переднезаднем размерах ^{11 , 13} , но такое динамическое поведение клеток первоначально было неподтвержденным из-за невозможности наблюдать их в живой небной ткани. Недавно мы смогли непосредственно наблюдать это поведение, разработав новую технологию визуализации изображений, которая сочетает в себе генетические методы мыши с флуоресцентной маркировкой с конфокальной жировой визуализацией эксплантированных небных стеллажей.

Во-первых, для визуализации динамического клеточного поведения в эпителиальных клетках неба во время слияния неба мы создали эпителиальную репортерную мышь, пересекая мышей ROSA26-mTmG ^flox с мышами ^{14 , 15} Keratin14-cre . Конфокальные живые изображения культивирования неба в результате образования эмбрионов подтвердили некоторые ранее предложенные клеточные поведения и выявили новые события в процессе слияния ⁶ </SUP>. Выдвижения эпителиальных клеточных мембран предшествовали первоначальному клеточному клеточному контакту, за которым следовала эпителиальная конвергенция путем интеркаляции клеток и смещения овальных клеток. Примечательно, что мы также обнаружили, что экструзия клеток, процесс, который, как известно, играет важную роль в эпителиальном гомеостазе, был основным механизмом, приводящим к вторичному слиянию неба ^{6 , 16} . Этот метод визуализации можно использовать с другими линиями репортера; Мы использовали трансгенные мыши Lifeact-mRFPruby ^{17 , 18} для изучения динамики цитоскелета актина во время процесса слияния. Другие репортеры могут также использоваться для наблюдения за другими конкретными аспектами слияния неба, и этот метод может быть адаптирован как к лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, так и к конфокальной микроскопии спиннингового диска в зависимости от потребностей в изображении и доступности микроскопа. Живое изображение все чаще становится краеугольным подходом в биологии развития. ПартиCularly, черепно-лицевой морфогенез является сложным, и человеческие врожденные дефекты, которые влияют на лицо, являются общими. Этот конфокальный живой метод визуализации поможет улучшить понимание основных основных механизмов развития, а также истоков черепно-лицевых аномалий человека.