Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

Tissue Fusion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von mehreren Organen. Wichtige menschliche Geburtsfehler wie Spaltlippe und Gaumen, Spina bifida und Missbildungen des Herzens können aus Defekten der Gewebefusion resultieren ¹ . Maus-Sekundär-Gaumen-Fusion wurde intensiv untersucht, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Gewebefusion in der Entwicklung ^{2 , 3 , 4} kontrollieren. In der Maus beginnt die sekundäre Gaumenentwicklung um etwa E11.5 mit dem Auswachsen eines sekundären palatinalen Regals aus jedem der bilateralen Oberkieferprozesse. Das anfängliche Wachstum der Gaumenböden erfolgt senkrecht entlang der Zunge, bis etwa E14.0, zu welcher Zeit die Gaumenböden waagerecht über die Zunge hoch werden. Das medial gerichtete Wachstum führt zu einem physischen Kontakt zwischen den applizierten Epithelien der beiden palatinalen Regale und bildet die Mittellinie epitheliAl Naht (MES) bei E14.5. Die dazwischen MES müssen zwischen den sekundären palatal Regalen entfernt werden mesenchymale Konfluenz zu ermöglichen , und die Entwicklung eines intakten, vollständig verschmolzen Sekundär Gaumen durch E15.5 ^3.

Wie eine gemeinsame epitheliale MES-Zellschicht zwischen zwei getrennten Gaumenböden gebildet und dann entfernt wurde, um mesenchymale Konfluenz zu erreichen, war eine zentrale Frage in der Gaumenentwicklung. Basierend auf Maus-Histologie- und Elektronenmikroskopie (EM) -Studien, explantischen Kulturstudien und funktionellen Mausgenetik-Experimenten wurden in diesem Prozess mehrere grundlegende Zellverhalten verwickelt. Filopodienähnliche Projektionen aus dem medialen Randepithel MEE jedes palatinalen Regals erleichtern den Anfangskontakt ^{5 , 6} , gefolgt von einer Interkalation dieser Epithelzellen zu einer gemeinsamen MES ^{6 , 7} . Beseitigung der resultierenden gemeinsamen MESWurde vorgeschlagen, um durch drei nicht-exklusive Mechanismen vorzugehen. Frühe Studien mit histologischer Beobachtung und ex vivo- Linienverfolgung mit lebenswichtigen Farbstoffen zeigten, dass die MES durch epithelialen bis mesenchymalen Übergang (EMT) der MES-Zellen ^{8 , 9 entfernt werden könnte} , obwohl in jüngster Zeit die genetische Linienverfolgung von Epithelzellen die Unsicherheit erhöht hat Der langfristige Beitrag der Epithelzellen zum Gaumenregal Mesenchym ^{10 , 11 , 12} . Eine signifikante Anzahl von apoptotischen Zellen und eine Verringerung ihrer Zahl in einigen Mutanten, die einer ordentlichen Gaumenfusion nicht unterliegen, hat zu der Vorstellung geführt, dass Apoptose ein wichtiger Treiber der MES-Auflösung ^{2 , 3 sein kann} . Schließlich basiert zunächst auf Studien mit epithelialer Markierung und statischer Beobachtung zu progressiven Zeitpunkten, MES-ZellenWurden vorgeschlagen, um in den oronasalen und anteroposterioren Dimensionen ^{11 , 13} zu wandern, aber solche dynamischen Zellverhalten wurden zunächst unbestätigt wegen einer Unfähigkeit, sie in lebendem palatinalem Gewebe zu beobachten. In letzter Zeit konnten wir diese Verhaltensweisen direkt beobachten, indem wir eine neue Live-Imaging-Methodik entwickelten, die mäusegenetische Methoden der fluoreszierenden Markierung mit konfokaler Live-Imaging von explantierten Palastregalen kombiniert.

Zuerst, um dynamische zelluläre Verhaltensweisen in Gaumenepithelzellen während der ^Gaumenfusion zu visualisieren, erzeugten wir eine epithelspezifische Reportermaus, indem wir ROSA26-mTmG- ^Flox- Mäuse mit Keratin14-cre- Mäusen ^{14 , 15} kreuzten . Die konfokale Live-Darstellung der Gaumen-Explantat-Kultur der resultierenden Embryos bestätigte einige zuvor vorgeschlagene zelluläre Verhaltensweisen und identifizierte neuartige Ereignisse im Fusionsprozess ⁶ </Sup>. Epithelzellmembranvorsprünge gingen dem anfänglichen Zellzellkontakt voraus, gefolgt von einer epithelialen Konvergenz durch Zellinterkalation und oronasale Zellverdrängung. Bemerkenswerterweise haben wir auch entdeckt, dass die Zellextrusion, ein Prozeß, der berichtet wurde, um wichtige Rollen in der epithelialen Homöostase zu spielen, ein wichtiger Mechanismus war, der die Maus sekundäre Gaumenfusion ^{6 , 16} antrieb. Diese Abbildungsmethode kann mit anderen Reporterlinien verwendet werden; Wir haben Lifeact-mRFPruby- transgene Mäuse ^{17 , 18 verwendet} , um die aktin- zytoskeletale Dynamik während des Fusionsprozesses zu untersuchen. Andere Reporter können auch eingesetzt werden, um andere spezifische Aspekte der Gaumenfusion zu beobachten, und diese Methode kann entweder auf die Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie oder die Spinndiskette konfokale Mikroskopie angepasst werden, je nach Abbildungsbedarf und Mikroskopverfügbarkeit. Live-Imaging wird zunehmend zum Keystone-Ansatz in der Entwicklungsbiologie. PartiCulario, kraniofaziale Morphogenese ist komplex und menschliche Geburtsfehler, die das Gesicht beeinflussen, sind üblich. Diese konfokale Live-Imaging-Methode wird dazu beitragen, ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden grundlegenden Entwicklungsmechanismen sowie Ursprünge von menschlichen kraniofazialen Anomalien zu ermöglichen.