Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos ¹ . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo ^{2 , 3 , 4} . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el crecimiento de un estante palatino secundario de cada uno de los procesos maxilares bilaterales. El crecimiento inicial de los estantes palatales se produce verticalmente a lo largo de la lengua, hasta aproximadamente E14.0, momento en el cual los estantes palatales se elevan horizontalmente por encima de la lengua. El crecimiento medialmente dirigido da como resultado el contacto físico entre los epitelios de las dos estanterías palatinas, formando el epitelio de la línea mediaAl costura (MES) en E14.5. El MES intermedio debe ser removido de entre los estantes palatales secundarios para permitir la confluencia mesenquimal y el desarrollo de un paladar secundario intacto, completamente fusionado por E15.5 ³ .

La forma en que se forma una capa epitelial compartida de células MES entre dos estantes palatales separados, y luego se eliminan para lograr la confluencia mesenquimal, ha sido una cuestión central en el desarrollo del paladar. Basado en estudios histológicos y de microscopía electrónica de ratón (EM), estudios de cultivos de explantes y experimentos genéticos de ratón, varios comportamientos celulares fundamentales han sido implicados en este proceso. Las proyecciones de tipo filopodia del epitelio del borde mediano MEE de cada estante palatino facilitan el contacto inicial ^{5 , 6} , seguido de la intercalación de estas células epiteliales a una MES única compartida ^{6 , 7} . Eliminación de la MES compartida resultanteHa sido propuesto para proceder por tres mecanismos no exclusivos. Los primeros estudios que emplean observación histológica y ex vivo linaje rastreo con colorantes vitales indicaron que las MES pueden ser removidos por transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células MES ^{8, 9,} aunque más recientemente, genética rastreo de linaje de las células epiteliales ha planteado incertidumbre en cuanto a La contribución a largo plazo de las células epiteliales al mesénquima del estante palatal ^{10 , 11 , 12} . Un número significativo de células apoptóticas, y una reducción en su número en algunos mutantes que no se someten a la fusión adecuada paladar ha llevado a la idea de que la apoptosis puede ser un importante conductor de MES disolución [ ^{2 , 3]} . Finalmente, basándose inicialmente en estudios con etiquetado epitelial y observación estática en puntos de tiempo progresivos, las células MESSe propusieron migrar en las dimensiones oronasal y anteroposterior ^{11 , 13} , pero estos comportamientos celulares dinámicos fueron inicialmente no confirmados debido a la incapacidad de observarlos en tejido palatino vivo. Recientemente, hemos sido capaces de observar directamente estos comportamientos mediante el desarrollo de una nueva metodología de imagen en vivo que combina los métodos genéticos de ratón de marcado fluorescente con confocal imágenes en vivo de estantes palatales explantados.

Primero, para visualizar los comportamientos celulares dinámicos en las células epiteliales del paladar durante la fusión del paladar, se generó un ratón reportero epitelial específico cruzando ROSA26- ^mTmG ratones flox con ratones Keratin14-cre ^{14 , 15} . Confocal imágenes en vivo del cultivo de explante paladar de los embriones resultantes confirmó algunos propuesto anteriormente los comportamientos celulares e identificaron nuevos eventos en el proceso de fusión ⁶ </Sup Las protrusiones de la membrana de las células epiteliales precedieron al contacto inicial célula-célula, seguido por la convergencia epitelial por intercalación celular y desplazamiento celular oronasal. En particular, también descubrió que la extrusión celular, un proceso que se informó que desempeñan un papel importante en la homeostasis epitelial, fue un importante mecanismo de conducción del ratón paladar secundario fusión ^{6 , 16} . Este método de formación de imágenes se puede usar con otras líneas de reportero; Utilizamos Lifeact-mRFPruby ratones transgénicos ^{17 , 18} para examinar la dinámica del citoesqueleto actina durante el proceso de fusión. También se pueden emplear otros reporteros para observar otros aspectos específicos de la fusión del paladar y este método puede adaptarse a microscopía confocal de barrido láser o microscopía confocal de disco giratorio, dependiendo de las necesidades de formación de imágenes y de la disponibilidad del microscopio. La imagen en vivo se está convirtiendo cada vez más en un enfoque clave en la biología del desarrollo. PartiCularmente, la morfogénesis craneofacial es compleja y los defectos congénitos humanos que afectan la cara son comunes. Este método confocal de imágenes en vivo ayudará a permitir una mejor comprensión de los mecanismos básicos de desarrollo subyacentes, así como los orígenes de las anomalías craneofaciales humanas.