تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للتصوير الحي من الماوس الانصهار الحنك الثانوي باستخدام المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل الفلورسنت، ومع مثبطات المسار لبصيرة الميكانيكية. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للتصوير الحي في النظم التنموية الأخرى.
Abstract
انصهار الرفوف الحنكية الثانوية لتشكيل الحنك الثانوي سليمة هو عملية رئيسية في تطوير الثدييات وانقطاعه يمكن أن يؤدي إلى الحنك الثانوي الحلق، وهو شذوذ خلقي مشترك في البشر. وقد تم دراسة اندماج الحنك الثانوي على نطاق واسع مما أدى إلى العديد من الآليات الخلوية المقترحة التي قد توسط هذه العملية. ومع ذلك، فقد أجريت هذه الدراسات في الغالب على الأنسجة الجنينية الثابتة في نقاط زمنية التقدمية أثناء التنمية أو في الثقافات المستكشفة الثابتة تحليلها في نقاط زمنية ثابتة. تحليل ثابت محدود لتحليل العمليات التشكلية الديناميكية مثل الانصهار الحنك وما هي أنواع السلوكيات الخلوية الديناميكية توسط الانصهار الحنكي غير مفهومة تماما. نحن هنا وصف بروتوكول للتصوير الحي من السابقين فيفو الانصهار الحنك الثانوي في أجنة الماوس. لدراسة السلوكيات الخلوية من الانصهار الحنك، تم استخدام كيراتين 14 -cre الظهارية لتسمية الخلايا الظهارية الحنك في روسA26- متمغ الأجنة مراسل فلوكس . لتصور أكتين الخيطية، استخدمت الفئران مراسل ليفاكت-مرفبروبي . تم إجراء التصوير الحي من الانصهار الحنك الثانوي عن طريق تشريح الرفوف الحنكية الثانوية انضمت مؤخرا من الجنينية يوم (E) 14.5 مرحلة الأجنة وزراعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على الاغاروز على طبق القاع الزجاج لتمكين التصوير مع المجهر متحد البؤر مقلوب. باستخدام هذه الطريقة، لقد اكتشفنا مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلوية الرواية خلال الانصهار الحنك الثانوي. إن تقدير كيفية تنسيق سلوكيات الخلايا المتميزة في المكان والزمان يسهم إلى حد كبير في فهمنا لهذه العملية التشكلية الديناميكية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على خطوط الماوس متحولة، أو الثقافات تعامل مع مثبطات الدوائية لمواصلة دفع فهم كيفية السيطرة على الانصهار الحنك الثانوي.
Introduction
الأنسجة الانصهار هو خطوة هامة في تطوير أجهزة متعددة. يمكن أن تشوه العيوب البشرية الرئيسية مثل الشفة المشقوقة والحنك، السنسنة المشقوقة وتشوهات القلب من عيوب في انصهار الأنسجة 1 . وقد تم دراسة الماوس الماوس الحنك الانصهار على نطاق واسع لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على انصهار الأنسجة في التنمية 2 ، 3 ، 4 . في الماوس، يبدأ تطوير الحنك الثانوي في جميع أنحاء E11.5 مع ثمار الرف الحنكي الثانوي من كل من العمليات الفك العلوي الثنائية. النمو الأولي للرفوف الحنكية يحدث عموديا على طول اللسان، حتى حوالي E14.0، في ذلك الوقت، رفوف الحنك تصبح مرتفعة أفقيا فوق اللسان. يؤدي النمو الموجه وسطيا إلى الاتصال الجسدي بين ظهارة التطبيق من الرفوف الحنكية اثنين، وتشكيل خط الوسط إبيثيليآل سيم (ميس) عند E14.5. يجب إزالة ميس ميس من بين الرفوف الحنكية الثانوية للسماح التقاء الوسيطة وتطوير سليمة، تنصهر تماما الحنك الثانوي من قبل E15.5 3 .
كيف يتم تشكيل طبقة الخلية الظهارية الخلية ميس بين اثنين من رفوف الحنجرة منفصلة، ومن ثم إزالتها لتحقيق كونفلنسي الوسيطة، وكان السؤال الرئيسي في التنمية الحنك. استنادا إلى دراسات الماوس المجهري والإلكترون المجهري (إم) والدراسات ثقافة إكسلانت، والتجارب الوراثة الماوس وظيفية، وقد تورطت العديد من السلوكيات الخلية الأساسية في هذه العملية. الإسقاطات مثل فيلوبوديا من الحافة الإنسية ظهارة مي من كل رف الحنطة يسهل الاتصال الأولي 5 ، 6 ، تليها إقحام هذه الخلايا الظهارية إلى ميس واحد مشترك 6 ، 7 . إزالة المحطة ميس المشتركة الناتجةاقترح المضي قدما بثلاث آليات غير حصرية. وأشارت الدراسات المبكرة التي تستخدم الرصد النسيجي والجسم الحي خارج تتبع المفردات مع الأصباغ الحيوية أن ميس يمكن إزالتها عن طريق الظهارية إلى الانتقال الوسيطة (إمت) من الخلايا ميس 8 ، 9 ، على الرغم من أن في الآونة الأخيرة، تتبع النسب الوراثية للخلايا الظهارية أثار عدم اليقين فيما يتعلق والمساهمة على المدى الطويل من الخلايا الظهارية إلى الحنك الحنكي اللحمة المتوسطة 10 ، 11 ، 12 . وقد أدت أعداد كبيرة من الخلايا الأبوطوزية، وانخفاض في عددهم في بعض المسوخ التي تفشل في الخضوع الصحيح الانصهار الحنك إلى فكرة أن موت الخلايا المبرمج قد يكون المحرك الرئيسي لحل ميس 2 ، 3 . وأخيرا، استنادا في البداية على الدراسات التي تنطوي على وضع العلامات الظهارية والملاحظة ثابتة في تيمبوانتس التقدمية، خلايا ميسقد اقترحت على الهجرة في أبعاد الأوعية و الأمامي الخلفي 11 ، 13 ، ولكن هذه السلوكيات خلية ديناميكية في البداية غير مؤكدة بسبب عدم القدرة على مراقبتها في الأنسجة الحنكية الحية. في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على مراقبة مباشرة هذه السلوكيات من خلال تطوير منهجية التصوير الحية الجديدة التي تجمع بين الأساليب الوراثية الماوس من وضع العلامات الفلورسنت مع التصوير المباشر مبائر من الرفوف الحنكية إكسلانتيد.
أولا، لتصور السلوكيات الخلوية الديناميكية في الخلايا الظهارية الحنك أثناء الانصهار الحنك، أنشأنا الماوس مراسل الظهارية محددة عن طريق عبور ROSA26- متمغ الفئران فلوكس مع الفئران Keratin14-كري 14 ، 15 . وأكد التصوير مبائر الحية من ثقافة الحنك إكسلانت من الأجنة الناتجة بعض السلوكيات الخلوية المقترحة سابقا وحددت الأحداث الرواية في عملية الاندماج 6 </سوب>. الظهارية نتوءات غشاء الخلية مسبقة الأولي خلية خلية الاتصال تليها التقارب الظهارية عن طريق إقحام الخلية وتشريد الخلايا الأنفية. ومن الجدير بالذكر، اكتشفنا أيضا أن قذف الخلية، وهي عملية ذكرت للعب الأدوار الهامة في التوازن الظهاري، كان آلية رئيسية تدفع الماوس الانصهار الحنك الثانوي 6 ، 16 . هذا الأسلوب التصوير يمكن استخدامها مع خطوط مراسل أخرى. استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا ليفيكت-مرفبروبي 17 ، 18 لدراسة ديناميات الهيكل الخلوي أكتين أثناء عملية الانصهار. ويمكن أيضا للصحفيين الآخرين أن تستخدم لمراقبة جوانب محددة أخرى من الانصهار الحنك ويمكن تكييف هذه الطريقة إما ليزر المسح متحد البؤر المجهري أو الغزل القرص المجهري متحد البؤر، اعتمادا على احتياجات التصوير والمجهر توافر. أصبح التصوير الحي على نحو متزايد نهجا رئيسيا في علم الأحياء التنموي. حزببشكل رئيسي، التشكل القحفي الوجهي هو التشوهات المعقدة والإنسانية التي تؤثر على الوجه شائعة. وهذا مبهجة طريقة التصوير الحية تساعد على تمكين فهم أفضل للآليات التنموية الأساسية الكامنة وكذلك أصول تشوهات القحف القحفي البشري.
Protocol
Representative Results
Discussion
التصوير الحي من التشكل الأنسجة مع 3D ثقافة الجهاز إكسلانت يمكن أن توفر معلومات مفصلة بشأن العمليات الخلوية التي لا يمكن أن تظهر في تحليل تلطيخ التقليدية من أقسام الأنسجة الثابتة. باستخدام في المختبر ثقافة إكسلانت من الماوس الحنك الثانوي الجنينية، لاحظنا العديد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر M. دوغلاس بينسون لإجراء محادثات أولية بشأن التصوير الحنك الثانوي. ونحن نعترف أيضا ديفيد كاستانيدا كاستيلانوس (لايكا) وكريس رييكين (زايس) لمساعدتهم على ضبط ظروف التصوير في المجهر متحد البؤر. نحن نقدر لينزي هاميلتون (بيتبلان) للحصول على اقتراحات مفيدة لتحليل الصور الكمية باستخدام برنامج إماريس. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيدر R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
