Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine raffinierte Protokoll um effektiv biotinylierte Dextran Amin (BDA) Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Färbung Methode durch eine wechselseitige neuronale Weg zu offenbaren. Es ist geeignet für die Analyse der Feinstruktur des BDA Etikettier- und unterscheidet sie von anderen neuralen Elemente unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop.
Abstract
Hochmolekularen biotinylierte Dextran Amin (BDA) hat seit vielen Jahrzehnten als hochsensible neuroanatomischen Tracer verwendet worden. Da die Qualität der Beschriftung durch verschiedene Faktoren, die hier betroffen war bieten wir eine raffinierte Protokoll für die Anwendung des hohen Molekulargewichts BDA für optimale neuronale Kennzeichnung in das zentrale Nervensystem zu studieren. Nach Stereotaktische Injektion von BDA in den ventralen Posteromedial Kern (VPM) des Thalamus bei der Ratte durch eine zarte Glaspipette war BDA mit fluoreszierenden Streptavidin-Alexa (AF) 594 befleckt und counterstained mit fluoreszierenden Nissl Fleck AF500/525. Auf dem Hintergrund der grünen Nissl Färbung die roten BDA Kennzeichnung, einschließlich der neuronalen Zellkörpern und axonalen Terminals, deutlicher im somatosensorischen Cortex zeigte. Darüber hinaus verdoppelt fluoreszierende Färbung für BDA und die Kalzium-bindenden Proteins Parvalbumin (PV) wurde durchgeführt, um die Korrelation von BDA Kennzeichnung und PV-positiven Interneuronen im kortikalen Ziel, bietet die Möglichkeit, die lokale neuronale studieren zu beobachten Schaltungen und deren chemischen Eigenschaften. Also, diese raffinierte Methode eignet sich nicht nur zur Visualisierung von hochwertigen neuronale Markierung mit hohem Molekulargewicht BDA durch gegenseitige Nervenbahnen zwischen Thalamus und Großhirnrinde, aber auch erlauben die gleichzeitige Vorführung von andere neuronale Marker mit fluoreszierenden Histochemie oder Immunchemie.
Introduction
Hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht), eine hochempfindliche Tracer für tracing Nervenbahnen in das Zentralnervensystem für über 20 Jahre1verwendet worden. Obwohl die Verwendung des BDA eine gemeinsame neuronale Trakt tracing Technik, kann die Qualität der BDA Kennzeichnung bei Tieren durch verschiedene Faktoren1,2,3beeinflusst werden. Unsere aktuelle Studie darauf hingewiesen, dass die optimale Struktur der BDA Beschriftung ist nicht nur eine richtige nach der Injektion Überlebenszeit zugeordnet, sondern auch mit der Färbung Methode4 korreliert. Bis jetzt, konventionelle Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC), Streptavidin-Fluorescein erfolgt und Streptavidin-AF594 dienten Färbung Methoden zur Aufdeckung der BDA Kennzeichnung in früheren Studien2,3, 4,5. Im Vergleich dazu kann fluoreszierende Färbung für BDA einfach durchgeführt werden.
Um die Anwendung der hochmolekularen BDA zu verlängern, wurde in der vorliegenden Studie eine raffinierte Protokoll eingeführt. Im Anschluss an die Injektion von BDA in der VPM des Thalamus im rattengehirn war BDA Kennzeichnung, offenbart durch die reguläre Methode der standard ABC Färbung sowie durch doppelte fluoreszierende Färbung, die für die Beobachtung der Korrelation der BDA Kennzeichnung durchgeführt wurde und einfach neuralen Elemente oder Interneuronen im kortikalen Ziel mit Streptavidin-AF594 und fluoreszierende Nissl Histochemie oder PV-Immundiagnostik, beziehungsweise. Durch die gegenseitige Nervenbahnen zwischen VPM und die primären somatosensorischen Cortex (S1)6,7,8konzentrierten wir uns unsere Beobachtung auf BDA Kennzeichnung in die Thalamocortical projiziert Axone und corticothalamic projizierte Zelle Somas in der S1. Durch diesen Prozess voraussichtlich nicht nur ein detailliertes Protokoll für den Erhalt der hohen Qualität der neuronalen Etikettieren mit hohem Molekulargewicht BDA, sondern auch eine raffinierte Protokoll über die Kombination von fluoreszierenden BDA Kennzeichnung und andere fluoreszierende neuronale Marker mit Histochemie oder Immunchemie. Dieser Ansatz ist vorzuziehen, den lokalen neuronale Schaltkreise und ihre chemischen Eigenschaften unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Auswahl einer richtigen Tracers ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche neuronale Ablaufverfolgung Experiment. In der Familie der BDA, hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht) wurde empfohlen, bevorzugt durch die Anterograde neuronalen Signalweg im Gegensatz zu niedermolekularen BDA (3.000 Molekulargewicht)2,3 transportiert werden , 11 , 12 , 13….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Projekt Code Nr. 81373557, Nr. 81403327) finanziert.
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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