تحسين تطبيق أمين ديكستران بيوتينيلاتيد عالية الوزن الجزيئي للإسقاط ثالاموكورتيكال تتبع في الفئران
Summary
نقدم هنا، بروتوكول المكرر لفعالية الكشف عن بيوتينيلاتيد ديكستران أمين (BDA) وسم مع الفلورسنت تلطيخ الأسلوب من خلال مسار العصبية المعاملة بالمثل. ومناسبة لتحليل بنية غرامة من BDA وسم ويميزه عن سائر العناصر العصبية تحت ليزر [كنفوكل] مجهر مسح.
Abstract
ارتفاع الوزن الجزيئي بيوتينيلاتيد ديكستران أمين (BDA) استخدمت الراسم نيورواناتوميكال درجة عالية من حساسية لعقود عديدة. نظراً لتأثر نوعية وصفها عوامل مختلفة، من هنا، نحن نقدم بروتوكول المكرر لتطبيق عالية الوزن الجزيئي BDA لدراسة وضع العلامات العصبية الأمثل في الجهاز العصبي المركزي. بعد ضخ BDA المناظير باستخدام الأشعة في نواة بوستيروميديال البطني (VPM) المهاد في الفئران من خلال ماصة زجاجية حساسة، ملطخة بنيون ستريبتافيدين-أليكسا (AF) 594 BDA وكونتيرستينيد بوصمة عار الفلورسنت نسل AF500/525. على خلفية خضراء نسل تلطيخ، العلامات BDA الحمراء، بما في ذلك الهيئات الخلايا العصبية ومحطات محواري، أكثر اختلافاً واضحا تجلى في قشرة سوماتوسينسوري. وعلاوة على ذلك، مضاعفة تلطيخ الفلورسنت ل BDA وأجرى بارفالبومين البروتين الكالسيوم الملزمة (PV) لمراعاة الترابط بين وسم BDA وإينتيرنيورونس الكهروضوئية-الإيجابية في الهدف القشرية، وإتاحة الفرصة لدراسة المحلية العصبية الدوائر وخصائصها الكيميائية. وهكذا، هذا الأسلوب المكرر ليس فقط مناسبة لتصور وضع العلامات مع الوزن الجزيئي عالية BDA من خلال المسارات العصبية المتبادل بين قشرة الدماغ والمهاد العصبية ذات جودة عالية، ولكن سوف تسمح أيضا مظاهرة متزامنة من علامات العصبية الأخرى مع نيون هيستوتشيميستري أو إيمونوتشيميستري.
Introduction
ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (الوزن الجزيئي 10,000)، تتبع حساسة للغاية، وقد استخدمت لتتبع المسارات العصبية في الجهاز العصبي المركزي لما يزيد على 20 سنة1. على الرغم من أن استخدام BDA المسالك العصبية شائعة تتبع الأسلوب، يمكن أن تتأثر نوعية BDA وسم في الحيوانات بمختلف العوامل1،،من23. دراستنا الأخيرة أشارت إلى أن الهيكل الأمثل لوسم BDA هو المرتبطة بوقت مناسب بعد انتهاء حقن بقاء، بل يرتبط أيضا ب أسلوب المصبوغة4. حتى الآن، ومجمع عبدين-البيوتين-البيروكسيديز التقليدية (ABC)، streptavidin-fluorescein isothiocyanate، وستريبتافيدين-AF594 استخدمت أساليب المصبوغة للكشف عن العلامات BDA في الدراسات السابقة2،3، 4،5. وبالمقارنة، صبغة الفلورسنت ل BDA يمكن بسهولة إجراء.
بغية توسيع نطاق تطبيق عالية الوزن الجزيئي BDA، أدخل بروتوكول المكرر في هذه الدراسة. عقب حقن BDA إلى VPM المهاد في الدماغ الفئران، وسم BDA كان كشفت بطريقة منتظمة لتلطيخ ABC القياسية وكذلك مزدوجة الفلورسنت تلطيخ، التي أجريت لرصد العلاقة بين العلامات BDA والأساسية العناصر العصبية أو إينتيرنيورونس في الهدف القشرية مع ستريبتافيدين-AF594 ونيون نسل هيستوتشيميستري أو PV-إيمونوتشيميستري، على التوالي. من خلال المسارات العصبية متبادلة بين VPM والقشرة الأولية somatosensory (S1)6،،من78، ركزنا ملاحظتنا على BDA وسم في محاور عصبية ثالاموكورتيكال المتوقعة وكورتيكوثالاميك حسام الخلية المتوقعة في S1. بهذه العملية، وكنا نتوقع أن يوفر بروتوكول مفصلة للحصول على الجودة العالية للعلامات العصبية مع ارتفاع الوزن الجزيئي BDA، ليس فقط، بل أيضا بروتوكول المكرر على المزيج من العلامات BDA الفلورسنت وغيرها علامات العصبية الفلورسنت مع هيستوتشيميستري أو إيمونوتشيميستري. وهذا النهج الأفضل لدراسة الدوائر العصبية المحلية وخصائصها الكيميائية تحت ليزر [كنفوكل] الفحص المجهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد تتبع الصحيح خطوة حاسمة لتجربة ناجحة من اقتفاء أثر العصبية. في عائلة BDA، عالية الوزن الجزيئي BDA (الوزن الجزيئي 10,000) وأوصى بشكل تفضيلي نقلها عن طريق المسار العصبية anterograde على النقيض من الوزن الجزيئي المنخفض BDA (الوزن الجزيئي 3,000)2،3 , 11 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذه الدراسة الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (مشروع القانون رقم 81373557؛ 81403327 رقم).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
