שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעודן לחשוף ביעילות biotinylated לתוספי אמין (BDA) תיוג עם פלורסנט צביעת שיטת דרך מסלול עצבי הדדיים. היא מתאימה לניתוח המבנה קנס של BDA תיוג, המבדיל אותו רכיבים עצביים אחרים תחת מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי.
Abstract
משקל מולקולרי גבוה biotinylated לתוספי אמין (BDA) שימש בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רגישה מאוד במשך עשורים רבים. מאז האיכות של תיוג שלה הושפע על ידי גורמים שונים, כאן, אנו מספקים פרוטוקול מעודן של יישום משקל מולקולרי גבוה BDA לימוד אופטימליים תיוג עצבי במערכת העצבים המרכזית. לאחר הזרקת סטיאוטטי BDA לתוך הגרעין הגחוני posteromedial (VPM) של התלמוס בחולדה באמצעות פיפטה מזכוכית עדינה, BDA היה מוכתם streptavidin פלורסנט-(AF) 594 אלקסה, counterstained עם Nissl פלורסנט הכתם AF500/525. על הרקע של צביעת Nissl ירוק, אדום BDA תיוג, כולל מסופים עצב, וגופי תאים עצביים היה ביתר בירור הפגינו קליפת המגע. יתר על כן, להכפיל מכתים פלורסנט עבור BDA וביצעו סידן מחייב חלבון parvalbumin (PV) היה להתבונן הקורלציה של BDA תיוג ו interneurons PV-חיובית בתוך המטרה קורטיקלית, מתן הזדמנות ללמוד המקומי עצבית מעגלים ומאפיינים הכימי שלהם. לכן, בשיטה זו מעודן מתאים לא רק להמחיש באיכות גבוהה עצבית תיוג עם משקל מולקולרי BDA גבוהה דרך מסלולים עצביים הדדיים בין קליפת המוח תלמוס, אבל גם יאפשרו הדגמה סימולטני של סמנים עצביים אחרים עם להסטולוגיה פלורסנט או נוגדנים.
Introduction
משקל מולקולרי גבוה BDA (10,000 מולקולרית משקל), מכשיר מעקב רגישים, שימש במשך מעקב מסלולים עצביים במערכת העצבים המרכזית עבור יותר מ-20 שנים1. למרות השימוש BDA הוא משחק טרקטו עצבית נפוצות עקיבה טכניקה, האיכות של BDA תיוג עשויה להיות מושפעת בבעלי חיים שונים גורמים1,2,3. מחקר שנערך שלנו ציינו כי המבנה האופטימלי של BDA תיוג זה המשויך זמן הישרדות שלאחר הזרקה נכונה אלא גם בקורלציה עם שיטת צביעת4. עד עכשיו, מתחם אבידין-ביוטין-peroxidase קונבנציונאלי (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate, streptavidin-AF594 שיטות מכתימים שימשו חשיפת BDA תיוג הקודם מחקרים2,3, 4,5. לשם השוואה, צביעת פלורסנט עבור BDA ניתן בקלות לבצע.
על מנת להרחיב את היישום של משקל מולקולרי גבוה BDA, הוצג פרוטוקול מעודן במחקר הנוכחי. לאחר ההזרקה של BDA לתוך VPM של התלמוס במוח עכברוש, תיוג BDA היה חשף בשיטה הרגילה של צביעת ABC סטנדרטיים, כמו גם על ידי זוגי פלורסנט מכתים, אשר בוצע להתבוננות הקורלציה של BDA תיוג, בסיסי אלמנטים עצבית או interneurons בתוך המטרה קורטיקלית עם streptavidin-AF594, להסטולוגיה Nissl פלורסנט או PV-נוגדנים, בהתאמה. דרך מסלולים עצביים הדדיים בין VPM של קליפת המגע העיקרית (S1)6,7,8, התמקדנו שלנו תצפית על BDA תיוג thalamocortical מוקרן אקסונים ו corticothalamic somas תא המתוכננת ב ו- S1. באמצעות תהליך זה, אנו אמורים לספק לא רק פרוטוקול מפורט להשגת האיכות הגבוהה של תיוג עצביים עם משקל מולקולרי גבוה BDA, אלא גם פרוטוקול מעודנת על השילוב של תיוג BDA פלורסנט, סמנים עצביים אחרים פלורסנט עם להסטולוגיה או נוגדנים. גישה זו עדיפה ללמוד את המעגלים העצביים מקומיים ו שלהם מאפיינים כימיים תחת לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
בחירת מכשיר מעקב ראוי הוא שלב קריטי עבור ניסוי מוצלח עקיבה עצבית. במשפחה של BDA, משקל מולקולרי גבוה BDA (משקל מולקולרי 10,000) הומלץ מעדיפים להיות מועבר דרך מסלול עצבי anterograde בניגוד נמוך משקל מולקולרי BDA (משקל מולקולרי 3,000)2,3 , 11 , 12</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (פרוייקט קוד מס 81373557; 81403327 מס).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
- Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
- Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
- Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
- Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
- Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O’Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
- Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
- Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
- Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
- DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
- Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
- Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
- Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).
