トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善
Summary
ここでは、効果的に相互神経経路を通じて染色蛍光ラベリング ビオチン標識デキストラン アミン (BDA) を明らかにする洗練されたプロトコルを提案します。微細構造の解析に適しています bda ラベル付けおよび共焦点レーザー走査型顕微鏡の下で他の神経要素からそれを区別します。
Abstract
ビオチン標識デキストランの高分子量アミン (BDA) は多くの長年に渡って非常に敏感な神経解剖学的トレーサーとして使用されています。ラベルの記載事項の品質が、ここでは、さまざまな要因によって影響を受けるので、中枢神経系における最適なニューラル ラベリングを勉強するため高分子量 BDA のアプリケーション我々 には、洗練されたプロトコルが提供します。繊細なガラス製ピペットによるラット視床の後内側腹側核 (VPM) に BDA の定位注射後 BDA 蛍光ストレプトアビジン-Alexa (AF) 594 で染色、蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained。ニッスル染色緑の背景には、体性感覚野における赤 BDA ラベル付け、神経細胞の細胞体や軸索の端末を含むは示されたよりはっきりと。さらに、BDA の蛍光染色を倍増し、BDA のラベリングと皮質のターゲットでは、ローカルの神経を研究する機会を提供する太陽光発電肯定的な介在との相関を観察するカルシウム結合蛋白質パルブアルブミン (PV) を行った回路とその化学特性。したがって、この洗練されたメソッドだけは適していませんが高品質高分子量 BDA 視床と大脳皮質の間の相互の神経経路を介して標識神経を可視化するための同時デモを許可するも蛍光組織化学や免疫と他の神経マーカー。
Introduction
高分子量 BDA (10,000 の分子量)、高感度トレーサーは、20 年以上1中枢神経系の神経の経路をトレースするために使用されています。BDA の使用は一般的な神経路追跡法が、BDA のラベリングの品質を受けます動物の様々 な要因1,2,3。私たちの最近の研究では、BDA のラベルの最適な構造は、適切な投与後の生存時間に関連付けられているだけでなく、染色方法4とも相関を示されています。今、従来のアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC)、ストレプトアビジンかに、ストレプトアビジン AF594 まで染色法は以前研究2,3、BDA のラベル付けを明らかにするため使用されました。 4,5。比較では、BDA の蛍光染色を簡単に実行できます。
高分子量 BDA のアプリケーションを拡張するために洗練されたプロトコルは本研究で導入されました。ラット脳における視床 VPM に BDA の注入、BDA ラベリングした二重蛍光染色による、BDA のラベリングの相関関係を観察するため実施しただけでなく、正規標準 ABC 染色法によって明らかにされた、基本的です神経素子または介在ニューロン PV-免疫蛍光ニッスル組織化学やストレプトアビジン AF594 の皮質のターゲットにそれぞれ。VPM と一次体性感覚野 (S1)6,7,8間相互の神経経路を重点的に投影視床皮質軸索で視床ラベリング BDA の着眼点S1 で投影された細胞細胞体。これにより、高分子量 BDA、ニューラル ラベルの高品質を取得するための詳細なプロトコルだけでなく、BDA の蛍光標識の組み合わせと他の蛍光神経マーカーと洗練されたプロトコルを提供する予想組織化学や免疫。この方法は、局所神経回路と共焦点レーザ走査型顕微鏡の下で、化学的性質を研究することが望ましいです。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功した神経トレース実験のための重要なステップは、適切なトレースを選択します。BDA、高分子量 BDA の家族で (分子量 10,000) は、低分子量 BDA (分子量 3,000)2,3と対照をなして前向性神経経路を介して運ばれる優先的に推奨されました。,11,12,13。 ただし、多くの研究は?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、国家自然科学基金、中国の (プロジェクト コード番号 81373557; 号 81403327) によって賄われていた。
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
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