Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto
Summary
Qui, presentiamo un protocollo raffinato per rivelare efficacemente biotinilati ammina di destrano (BDA) etichettatura con una colorazione metodo attraverso un reciproco percorso neurale fluorescente. È adatto per analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali sotto un microscopio a scansione confocale del laser.
Abstract
Ammina di alto peso molecolare biotinilati destrano (BDA) è stato utilizzato come tracciante neuroanatomical altamente sensibile per molti decenni. Poiché la qualità della relativa etichettatura è stata influenzata da vari fattori, qui, forniamo un protocollo raffinato per l’applicazione ad alto peso molecolare BDA per studiare ottimale etichettatura neurale nel sistema nervoso centrale. Dopo l’iniezione stereotactic del BDA nel nucleo posteromedial ventrale (VPM) del talamo nel ratto mediante una pipetta di vetro delicato, BDA era macchiata con fluorescente streptavidina-Alexa (AF) 594 e controcolorato con fluorescente di Nissl AF500/525. Sullo sfondo di colorazione di Nissl verde, il rosso BDA etichettatura, tra cui corpi delle cellule neuronali e assonali terminali, è stata dimostrata più distintamente nella corteccia somatosensoriale. Inoltre, doppia colorazione fluorescente per BDA e la parvalbumina di proteine leganti il calcio (PV) è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni PV-positivi nella destinazione corticale, fornendo l’opportunità di studiare il locale neurale circuiti e le loro caratteristiche chimiche. Così, questo metodo raffinato non è solo adatto per la visualizzazione di alta qualità neurali etichettatura con l’alto peso molecolare BDA attraverso percorsi neurali reciproci tra il talamo e la corteccia cerebrale, ma anche permetterà la dimostrazione simultanea di altri marcatori neurali con istochimica fluorescente o immunochimica.
Introduction
Ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare), un tracciante altamente sensibile, è stato utilizzato per tracciare i percorsi neurali nel sistema nervoso centrale per oltre 20 anni1. Anche se l’uso del BDA è un comune delle vie neurali, analisi tecnica, la qualità del BDA etichettatura può risentire in animali vari fattori1,2,3. Il nostro studio recente ha indicato che la struttura ottima del BDA etichettatura è non solo connesso con un tempo di sopravvivenza post-iniezione corretta, ma anche correlata con la colorazione metodo4. Fino ad ora, convenzionale complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC), streptavidina-isotiocianato di fluoresceina e streptavidina-AF594 sono stati utilizzati metodi di colorazione per rivelare l’etichettatura BDA in precedenti studi2,3, 4,5. In confronto, colorazione fluorescente per BDA può essere facilmente eseguita.
Al fine di estendere l’applicazione ad alto peso molecolare BDA, è stato introdotto un protocollo raffinato nello studio presente. Dopo l’iniezione del BDA in VPM del talamo nel cervello del ratto, BDA etichettatura è stata rivelata dal regolare metodo di macchiatura di ABC standard così come dalla macchiatura fluorescente doppio, che è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e base gli elementi neurali o interneuroni nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e fluorescente Nissl istochimica o PV-immunochimica, rispettivamente. Attraverso i percorsi neurali reciproci tra VPM e la corteccia somatosensoriale primaria (S1)6,7,8, abbiamo focalizzato la nostra osservazione il BDA etichettatura negli assoni thalamocortical proiettata e corticothalamic somas proiettata cellula S1. Da questo processo, ci aspettavamo di fornire non solo un protocollo dettagliato per ottenere l’alta qualità di etichettatura neurali ad alto peso molecolare BDA, ma anche un raffinato protocollo sulla combinazione di contrassegno fluorescente BDA e altri marcatori fluorescenti neurali con l’istochimica o immunochimica. Questo approccio è preferibile per studiare i circuiti neurali locali e le loro caratteristiche chimiche sotto un laser confocale microscopia a scansione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selezionando un elemento tracciante corretto è un passo fondamentale per un esperimento di successo analisi neurale. Nella famiglia del BDA, ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare) è stato consigliato di essere preferenzialmente trasportato attraverso il percorso neurale anterograda contrariamente a basso peso molecolare BDA (peso molecolare 3.000)2,3 , 11 , 12 , <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dal National Foundation scienze naturali della Cina (progetto codice n. 81373557; n. 81403327).
Materials
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
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