Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Nuotatore e cellule Swarmer

I batteri sperimentano costantemente cambiamenti nel loro ambiente esterno e hanno sviluppato diverse tecniche per modificare e adattare il loro comportamento di conseguenza. Uno di questi meccanismi comporta la differenziazione in tipi cellulari distinti che meglio integrano l'ambiente alterato. La differenziazione comporta spesso importanti cambiamenti nella regolazione del ciclo cellulare, nella morfologia delle cellule e nell'organizzazione spaziale delle cellule. Un organismo che può subire la differenziazione è Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartiene alla Vibrionaceae , che è una famiglia di proteobatteri che abitano abitualmente acqua fresca o salata. Vibrionaceae sono ampiamente distribuite nell'ambiente e includono diverse specie che causano infezioni del tratto intestinale nell'uomo, incluso anche Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus è un organismo dimorfico ed è in grado di differenziarsi in due distinti tipi di cellule come risposta per accogliere i cambiamentiAmbiente esterno. In ambienti acquosi, esiste come una breve cella da nuoto a forma di bastoncello con un singolo flagello polare posizionato all'antico palo di cella. A contatto con la superficie, viene attivata la differenziazione in una cellula swarmer. La differenziazione delle cellule swarmer comporta due importanti cambiamenti: la morfogenesi delle cellule swarmer attraverso l'inibizione della divisione cellulare e l'induzione di un secondo sistema flagella. Ciò determina la formazione di una cellula swarmer a forma di forma a forma di forma e molto allungata, che può continuare lo stile di vita swarmer, dove gli eventi di divisione producono cellule swarmer di progenie o alternativamente si differenziano in cellule nuotatori.

Sono stati riportati diversi fattori per indurre o influenzare la differenziazione del swarmer. Lo stimolo primario sembra essere guidato da meccanosensing dove V. parahaemolyticus utilizza il flagello polare come un sensore tattile che rileva l'inibizione della rotazione sul contatto di superficie, ma sono coinvolti diversi altri fattoriBene ¹ . Nel laboratorio, la rotazione del flagello polare può essere inibita artificialmente mediante l'aggiunta di fenamil, che blocca la rotazione flagellare guidata dal canale sodico, inducendo così la differenziazione swarmer ² . Inoltre, in uno studio precedente , Vibrio alginolyticus è stato indotto a sciogliersi su supporti solidi quando le cellule sono state propagate su un mezzo di crescita in un piatto di Petri sigillato con chiaro nastro di plastica. La carta filtrante satura alcalina impediva lo swarming in queste condizioni, suggerendo pertanto che uno o più acidi volatili potrebbero essere coinvolti nell'induzione dello swarming. Così, sigillare il piatto di Petri con nastro di plastica probabilmente consentito per l'accumulo di acidi volatili, formati come sottoprodotti di metabolismo cellulare, all'interno dello spazio testa della piastra. Lo stesso effetto è stato raggiunto quando H2O2 è stato aggiunto al mezzo di crescita in piatti Petri non sigillati per produrre artificialmente acidi volatili idrolizzando i componenti mediali <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Tuttavia, l'identità di tali acidi volatili rimane sconosciuta. Inoltre, è stato dimostrato che l'eccesso di disponibilità del calcio ⁶ e della limitazione di ferro ⁷ aumentano entrambe la differenziazione e la proliferazione di swarmer sulle superfici solide. Le cellule possono essere affamate per il ferro aggiungendo il composto 2,2'-Bipyridyl al mezzo di crescita, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione del swarmer ⁸ . I fattori noti per la regolazione della differenziazione sono ora implementati nella progettazione di un protocollo che riproducibilmente induce la differenziazione di V. parahaemolyticus in cellule swarmer e la loro proliferazione sulle superfici agariche solide.

V. la differenziazione del parahaemolyticus comporta grandi cambiamenti nella regolazione della divisione cellulare, nella morfologia cellulare e nel posizionamento di macchine macromolecolari come flagellA e chemiotassi – processi che richiedono la localizzazione specifica delle proteine ​​secondo il ciclo cellulare. Così, la capacità di studiare la localizzazione intracellulare di tali proteine ​​è essenziale per la comprensione dei suddetti processi cellulari. Per eseguire tali studi è necessaria la microscopia a fluorescenza sulle singole cellule. Ciò può essere particolarmente impegnativo quando le cellule di immagini che esistono all'interno di popolazioni batteriche densi, come avviene per le cellule swarmer. Ci sono stati tentativi di indurre una differenziazione di swarmer in supporti liquidi, che potenzialmente potrebbero generare singole cellule per studi di microscopia. E sebbene su un livello trascrizionale queste cellule hanno in parte indotto il programma di differenziazione swarmer, non subiscono gli stessi cambiamenti morfologici distinti, come le cellule swarmer completamente differenziate coltivate su un mezzo solido ⁸ . Questo documento offre un protocollo robusto e riproducibile di un metodo per indurre swarmer ceLl differenziazione su una superficie di agar. Il protocollo produce una popolazione di cellule swarmer facilmente accessibili prontamente disponibili per la microscopia a cellule singole e successive analisi. Inoltre, il protocollo consente di localizzare studi di proteine ​​etichettate con fluorescenza in entrambi i tipi di nuoto e swarmer (sezioni 1, 2, 3, 4). Inoltre, il protocollo descrive il flusso di lavoro successivo su come elaborare e analizzare i dati generati dagli esperimenti di microscopia a fluorescenza, che consente l'analisi demografica delle società batteriche (sezione 5).