Induction de la différenciation cellulaire et de l'imagerie cellulaire unique<emVibrio parahaemolyticus</em> Swimmer and Swarmer Cells

Les bactéries connaissent constamment des changements dans leur environnement externe et ont développé plusieurs techniques pour modifier et adapter leurs comportements en conséquence. Un tel mécanisme implique une différenciation en types de cellules distinctes qui complètent mieux l'environnement altéré. La différenciation implique souvent des changements majeurs dans la régulation du cycle cellulaire, de la morphologie cellulaire et de l'organisation spatio-temporelle des cellules. Un organisme qui peut subir une différenciation est Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus appartient aux Vibrionaceae , qui est une famille de protéobactéries qui habitent habituellement des eaux fraîches ou salées. Les vibrionaceae sont largement distribués dans l'environnement et comprennent plusieurs espèces qui causent des infections intestinales chez les humains, y compris le Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus est un organisme dimorphique et peut se différencier en deux types cellulaires distincts en réponse à des changementsMilieu externe. Dans les environnements aqueux, il existe comme une petite cellule nageuse en forme de tige avec un seul flagelle polaire positionné à l'ancien pôle cellulaire. Lors du contact de surface, la différenciation dans une cellule de nerf est déclenchée. La différenciation cellulaire de Swarmer implique deux changements majeurs: la morphogenèse des cellules moustiques par l'inhibition de la division cellulaire et l'induction d'un deuxième système de flagelles. Il en résulte la formation d'une cellule de bourgeons peritrichous et hautement allongée, qui peut soit continuer le style de vie des mollusques, où les événements de division donnent naissance à des cellules moustiques de descendance, soit différencier de nouveau dans des cellules nageuses.

Plusieurs facteurs ont été rapportés pour induire ou influencer la différenciation des mollusques. Le stimulus primaire semble être conduit par des mechanosensing où V. parahaemolyticus utilise le flagelle polaire comme capteur tactile qui détecte l'inhibition de la rotation lors du contact de surface, mais plusieurs autres facteurs sont impliqués commeBien ¹ . En laboratoire, la rotation du flagelle polaire peut être inhibée artificiellement par addition de phénamil, ce qui bloque la rotation flagellaire entraînée par le canal de sodium, induisant ainsi une différenciation des fléaux ² . En outre, dans une étude antérieure , Vibrio alginolyticus a été induit à emmêler sur des milieux solides lorsque les cellules ont été propagées sur un milieu de croissance dans une boîte de Petri scellée avec un ruban adhésif transparent. Le papier filtre saturé alcalin a empêché de grouiller dans ces conditions, ce qui suggère qu'un ou plusieurs acides volatils pourraient être impliqués dans l'induction de l'essaimage. Ainsi, l'étanchéité de la boîte de Petri avec un ruban plastique permettait vraisemblablement l'accumulation d'acides volatils, formés comme sous-produits du métabolisme cellulaire, dans l'espace de tête de la plaque. Le même effet a été obtenu lorsque le H ₂ O ₂ a été ajouté au milieu de croissance dans des boîtes de Petri non scellées afin de produire artificiellement des acides volatils en hydrolysant les composants du média <supClasse = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Néanmoins, l'identité de ces acides volatils reste inconnue. En outre, il a été démontré que la disponibilité excessive de calcium ⁶ et de la limitation du fer ⁷ augmentait la différenciation et la prolifération des mollusques sur les surfaces solides. Les cellules peuvent être affamées pour le fer en ajoutant le composé 2,2'-Bipyridyle au milieu de croissance, ce qui a montré que cela influence la différenciation des mollusques ⁸ . Les facteurs connus pour réguler la différenciation sont maintenant mis en œuvre dans la conception d'un protocole qui induit de manière reproductible la différenciation de V. parahaemolyticus dans des cellules de moustaches et leur prolifération sur des surfaces solides d'agar.

La différenciation de V. parahaemolyticus implique des changements majeurs dans la régulation de la division cellulaire, la morphologie cellulaire et le positionnement de machines macromoléculaires telles que flagellA et chimiotaxis – processus qui nécessitent tous une localisation spécifique des protéines selon le cycle cellulaire. Ainsi, la capacité d'étudier la localisation intracellulaire de ces protéines est essentielle à la compréhension des processus cellulaires susmentionnés. Pour effectuer de telles études, il faut une microscopie à fluorescence sur des cellules individuelles. Cela peut être particulièrement difficile lors de l'imagerie des cellules qui existent dans des populations bactériennes denses, comme c'est le cas pour les cellules moustiques. Il a été tenté d'induire une différenciation des mollusques dans les milieux liquides, ce qui pourrait générer des cellules individuelles pour des études de microscopie. Et bien que, au niveau de la transcription, ces cellules ont induit partiellement le programme de différenciation des mollusques, elles ne subissent pas les mêmes changements morphologiques distincts que les cellules de bourgeons complètement différenciées cultivées sur un milieu solide ⁸ . Cet article offre un protocole robuste et reproductible d'une méthode pour induire un coccinelleSur une surface de gélose. Le protocole produit une population de cellules gonflées facilement accessibles facilement disponibles pour une microscopie à une seule cellule et une analyse ultérieure. En outre, le protocole permet des études de localisation des protéines marquées par fluorescence à la fois dans les types de cellules nageuses et moustiques (sections 1, 2, 3, 4). En outre, le protocole décrit le flux de travail ultérieur sur la façon de traiter et d'analyser les données générées à partir d'expériences de microscopie de fluorescence, ce qui permet une analyse démographique des sociétés bactériennes (section 5).