Indução de diferenciação celular e imagens de células<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Células Swimmer e Swarmer

As bactérias experimentam constantemente mudanças em seu ambiente externo e desenvolveram várias técnicas para mudar e adaptar seu comportamento de acordo. Um desses mecanismos envolve a diferenciação em diferentes tipos de células que melhor complementam o ambiente alterado. A diferenciação muitas vezes envolve grandes mudanças na regulação do ciclo celular, morfologia celular e organização espaciotemporal das células. Um organismo que pode sofrer diferenciação é Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus pertence às Vibrionaceae , que é uma família de proteobactérias que habitualmente habitam água fresca ou salgada. Vibrionaceae são amplamente distribuídos no ambiente e incluem várias espécies que causam infecções do trato intestinal em seres humanos, incluindo também Vibrio cholerae.V. Parahaemolyticus é um organismo dimórfico e é capaz de se diferenciar em dois tipos de células distintas como resposta para acomodar mudançasMeio externo. Em ambientes aquosos, existe como uma célula de nadador em forma de bastão com um único flagelo polar posicionado no antigo pólo da célula. No contato superficial, a diferenciação em uma célula swarmer é acionada. A diferenciação celular de Swarmer envolve duas alterações principais: a morfogénese das células mais vivas através da inibição da divisão celular e a indução de um segundo sistema de flagelos. Isto resulta na formação de uma célula swarmer em forma de bastão peritricos e altamente alongada, que pode continuar o estilo de vida do swarmer, onde os eventos de divisão resultam em células de progenitor swarmer, ou alternativamente diferenciar de volta para as células nadadoras.

Vários fatores têm sido relatados para induzir ou influenciar a diferenciação de swarmer. O estímulo primário parece ser conduzido por mechanosensing onde V. parahaemolyticus usa o flagelo polar como um sensor tátil que detecta a inibição da rotação em contato de superfície, mas vários outros fatores estão envolvidos comoPoço ¹ . No laboratório, a rotação do flagelo polar pode ser artificialmente inibida pela adição de fenamil, que bloqueia a rotação flagelar accionada pelo canal de sódio, induzindo assim a diferenciação do swarmer ² . Além disso, em um estudo anterior, Vibrio alginolyticus foi induzido a enxamear em meio sólido quando as células foram propagadas em meio de crescimento em uma placa de Petri selada com fita de plástico transparente. O papel de filtro saturado com alcali impediu o enxameamento nestas condições, sugerindo assim que um ou mais ácidos voláteis poderiam estar envolvidos na indução do enxame. Assim, vedar a placa de Petri com fita plástica permitiu provavelmente a acumulação de ácidos voláteis, formados como subprodutos do metabolismo celular, dentro do espaço da cabeça da placa. O mesmo efeito foi conseguido quando H ₂ O ₂ foi adicionado ao meio de crescimento em placas de Petri não seladas de modo a produzir artificialmente ácidos voláteis por hidrólise de componentes de meios <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . No entanto, a identidade de tais ácidos voláteis permanece desconhecida. Além disso, tem sido demonstrado que a disponibilidade excessiva de cálcio ⁶ e limitação de ferro ⁷ aumenta a diferenciação e proliferação de swarmer sobre superfícies sólidas. As células podem ser privadas de ferro por adição do composto 2,2'-Bipyridyl ao meio de crescimento, que tem sido mostrado para influenciar a diferenciação swarmer [ ^8] . Os factores conhecidos para regular a diferenciação são agora implementados na concepção de um protocolo que induz reprodutivamente a diferenciação de V. parahaemolyticus em células swarmer e a sua proliferação em superfícies sólidas de agar.

A diferenciação de V. parahaemolyticus envolve grandes alterações na regulação da divisão celular, morfologia celular e posicionamento de máquinas macromoleculares como flagellA e aparelhos de quimiotaxia – processos que requerem a localização específica de proteínas de acordo com o ciclo celular. Assim, a capacidade de estudar a localização intracelular de tais proteínas é essencial para a compreensão dos processos celulares acima mencionados. Para realizar tais estudos, a microscopia de fluorescência em células individuais é necessária. Isto pode ser particularmente desafiador quando imagens de células que existem dentro de populações bacterianas densas, como é o caso de células swarmer. Tem havido tentativas de induzir a diferenciação de swarmer em meios líquidos, que poderiam potencialmente gerar células individuais para estudos de microscopia. E embora a nível transcricional estas células tenham induzido parcialmente o programa de diferenciação de swarmer, não sofrem as mesmas alterações morfológicas distintas que as células swarmer totalmente diferenciadas crescidas em meio sólido ⁸ . Este trabalho oferece um protocolo robusto e reprodutível de um método para induzir ceLl em uma superfície de ágar. O protocolo produz uma população de células swarmer facilmente acessíveis prontamente disponíveis para microscopia de célula única e análise subsequente. Além disso, o protocolo permite estudos de localização de proteínas fluorescentemente marcadas em ambos os tipos de células nadadoras e swarmer (seções 1, 2, 3, 4). Além disso, o protocolo descreve o fluxo de trabalho subseqüente sobre como processar e analisar os dados gerados a partir de experiências de microscopia de fluorescência, o que permite a análise demográfica de sociedades bacterianas (seção 5).