Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Плоттеры и богомольцы

Бактерии постоянно испытывают изменения в своей внешней среде и разработали несколько методов изменения и адаптации своего поведения. Один из таких механизмов включает дифференциацию в различные типы клеток, которые лучше дополняют измененную среду. Дифференциация часто включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного цикла, морфологии клеток и пространственно-временную организацию клеток. Один организм, который может дифференцироваться, – Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus принадлежит к Vibrionaceae , который является семейством протеобактерий, которые обычно обитают в пресной или соленой воде. Vibrionaceae широко распространены в окружающей среде и включают в себя несколько видов, которые вызывают инфекции кишечного тракта у людей, в том числе Vibrio cholerae.В. Parahaemolyticus – диморфный организм и способен дифференцироваться в два разных типа клеток в ответ на изменение егоВнешняя среда. В водных средах он существует как короткая стержнеобразная плоская клетка с одиночным полярным жгутиком, расположенным на старом полюсе клетки. При поверхностном контакте запускается дифференциация в рояльную клетку. Дифференциация клеток Swarmer включает в себя два основных изменения: морфогенез стайчатых клеток через торможение клеточного деления и индукцию второй системы жгутиков. Это приводит к формированию перифричной и сильно вытянутой палочковидной рояльной клетки, которая может либо продолжить образ жизни рояля, где события деления приводят к появлению клеток рогатого потомства, либо, альтернативно, дифференцируются обратно в клетки пловца.

Сообщалось о нескольких факторах, вызывающих или влияющих на дифференцировку рояля. Первичный стимул, по-видимому, управляется механосенсингом, где V. parahaemolyticus использует полярный жгутик в качестве тактильного датчика, который обнаруживает ингибирование вращения при поверхностном контакте, но некоторые другие факторы задействованы в качествеСкважина ¹ . В лаборатории вращение полярного жгутика может быть искусственно ингибировано добавлением фенамила, который блокирует вегетарианное вращение натриевого канала, тем самым вызывая дифференцировку рояля ² . Кроме того, в более раннем исследовании Vibrio alginolyticus был индуцирован для роения на твердых средах, когда клетки размножались на ростовой среде в чашке Петри, запечатанной прозрачной пластиковой лентой. Насыщенная щелочью фильтровальная бумага препятствовала роению в этих условиях, поэтому предполагалось, что одна или несколько летучих кислот могут участвовать в индукции роения. Таким образом, герметизация чашки Петри пластиковой лентой, вероятно, позволила накапливать летучие кислоты, образующиеся в качестве побочных продуктов клеточного метаболизма, в пределах свободного пространства пластины. Тот же эффект был достигнут, когда H ₂ O ₂ был добавлен к ростовой среде в незапечатанных чашках Петри для искусственного получения летучих кислот путем гидролиза компонентов среды <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Тем не менее, идентичность таких летучих кислот остается неизвестной. Более того, было показано, что избыточная доступность кальция ⁶ и железа-ограничения ⁷ как усиливает размножение рояля, так и пролиферацию на твердых поверхностях. Клетки могут голодать из-за железа, добавляя соединение 2,2'-бипиридил в среду для роста, которая, как было показано, влияет на дифференцировку рояля ⁸ . Факторы, известные регулировать дифференцировку, теперь реализуются при разработке протокола, который воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в клетки рояля и их пролиферацию на твердых поверхностях агара.

V. parahaemolyticus дифференцировка включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного деления, клеточной морфологии и позиционирования макромолекулярных машин, таких как flagellА и хемотаксис – процессы, для которых все требуют специфической локализации белков в соответствии с клеточным циклом. Таким образом, способность изучать внутриклеточную локализацию таких белков является существенной для понимания вышеупомянутых клеточных процессов. Для проведения таких исследований требуется флуоресцентная микроскопия на отдельных клетках. Это может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в плотных бактериальных популяциях, как это имеет место для роевых клеток. Были попытки побудить дифференцировку рояля в жидких средах, которые могли бы потенциально генерировать отдельные клетки для микроскопических исследований. И хотя на уровне транскрипции эти клетки частично индуцировали программу размножения рояликов, они не подвергаются таким же отчетливым морфологическим изменениям, как полностью дифференцированные клетки свиньи, выращенные на твердой среде ⁸ . Эта статья предлагает надежный и воспроизводимый протокол метода, чтобы вызвать ройер се11 на поверхности агара. Протокол дает популяцию легкодоступных клеток свиньи, легко доступных для одноэлементной микроскопии и последующего анализа. Кроме того, протокол позволяет провести локализацию флуоресцентно меченых белков как в клетках пловец, так и в рояльных клетках (разделы 1, 2, 3, 4). Кроме того, протокол описывает последующий рабочий процесс о том, как обрабатывать и анализировать сгенерированные данные из экспериментов по флуоресцентной микроскопии, что позволяет проводить демографический анализ бактериальных сообществ (раздел 5).