Summary

磁気活性化細胞選別法により単離された血管周囲脂肪組織からの脂肪細胞前駆体の拡大および脂肪生成誘導

Published: June 30, 2017
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Summary

ここでは、MCS(Magnetic-Activated Cell Sorting)を用いた脈管内脂肪組織(PVAT)からの脂肪細胞前駆細胞(APC)集団の単離方法を報告する。この方法は、蛍光活性化細胞選別(FACS)と比較した場合、脂肪組織のグラム当たりのAPCの単離の増加を可能にする。

Abstract

パラクラインシグナリングを介した血管機能の主要調節因子である血管周囲脂肪組織(PVAT)の拡大は、肥満時の高血圧の発症に直接関連する。肥大および過形成の程度は、デポの位置、性別、および存在する脂肪細胞前駆細胞(APC)表現型のタイプに依存する。過去10年間のAPCおよび前脂肪細胞分離のために使用された技術は、個々の細胞が特定の細胞表面マーカーに基づいて同定され得る正確さを大幅に改善した。しかしながら、APCおよび脂肪細胞の単離は、特にインタクトな細胞を細胞培養適用のために保持しなければならない場合、細胞の脆弱性のために困難であり得る。

磁気活性化細胞選別( MCS)は、脂肪組織の重量単位あたりより多くの生存APCを単離する方法を提供する。 MCSによって回収されたAPCは、インビトロプロトコールでプレア成長因子カクテルを使用してそれらを脂肪細胞に分化させ、細胞によって保持された多分性および脂肪生成能の分析を可能にする。この実験は、拡張中の心臓血管疾患の発症において重要な役割を果たす大動脈および腸間膜のPVATデポーに焦点を当てた。これらのプロトコルは、定義されたAPC集団を分離し、拡大し、そして区別するための方法を記載する。このMCSプロトコルは、最小限の設備またはトレーニングで細胞選別が必要なあらゆる実験で分離を使用することを可能にする。これらの技術は、細胞表面マーカーの存在に基づいて特定の細胞集団の機能性を決定するさらなる実験を助けることができる。

Introduction

脈管周囲脂肪組織(PVAT)は、血管に近接しているため、脈管機能1における主要なパラクリンシグナル伝達成分である。この脂肪組織の拡大は、存在する脂肪細胞前駆細胞(APC)の表現型に依存する2,3 。脂肪組織からの細胞の単離は、主要な脂肪細胞が壊れやすく、浮力があり、大きさの範囲があるため、困難である。特定の単離技術はまた、炎症性タンパク質合成を増加させ、脂肪生成遺伝子発現を減少させることによって細胞表現型および形態を変えることができ、細胞の完全性を維持するプロトコルの重要性を強調する。

初代細胞および特異的前脂肪細胞亜集団の培養は、インビボ増殖に対する還元主義的アプローチを提供し、同等の細胞遺伝的メイクアップ5を維持するが、これらの細胞の私は、老化や老化による劣化のために制限されています6 。皮下および大網デポーを含む様々な脂肪デポーからの前脂肪細胞もまた、特定の解剖学的部位から細胞を集めることの重要性を強調する増殖の差異7を示す。非PVAT白色脂肪細胞由来の前駆細胞は、以前の研究7,8,9において特徴付けられてきたが、PVAT APC表現型についてはあまり知られていない。

ここに記載された技術は、形態学、生存能力、および増殖および分化の可能性に最小限の影響を及ぼしながら、特異的および限定されたAPC集団の分析を可能にする。ビーズが細胞を変えずに溶解するので、磁気活性化細胞選別(MCS)は、培養などの下流の適用に適している。 MCSもまた経済的であり、一旦、抗体の欠点フローサイトメトリーアッセイの必要性は最小限に抑えられています。 PVAT前駆体を用いたインビトロ研究はまた、これらの初代細胞が有する可能性を垣間見ることができる。

Protocol

本書に記載されているすべての手順は、ミシガン州立大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって制定されたガイドラインに従います。すべてのバッファーとメディアを光から保護する必要があります。 緩衝液、培地および器具の調製 (KRBB):135mM塩化ナトリウム、5mM塩化カリウム、1mM硫酸マグネシウム、0.4mMリン酸二水素カリウム、5.5mMグルコース、…

Representative Results

前脂肪細胞の増殖能力および脂肪細胞前駆体の脂肪生成能は、インビトロで維持される特性である11 。定量的DNAアッセイを用いてプレーティングした8,24,48および96時間後に、雄ラットのaPVAT、mPVAT、およびGONから単離したSVFおよびAPCのin vitro増殖を評価した。同じサイトのSVF細胞( 図1 )と比較して96時間の増殖が?…

Discussion

本実験の中心的な焦点は、PVATデポからのAPCの単離、拡大、および脂肪生成誘発である。ここでは、表面マーカーCD34およびPDGFRαを発現する細胞の同定に基づいて、APCの単離のためのプロトコールを提示する。これらの表面タンパク質は、APC上で、高い増殖速度および様々な脂肪貯蔵庫14,15中の白色または褐色脂肪細胞に分化する可能性を伴って以前に同定された。これらの?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Contreras and Watts Laboratoriesとウィリアム・ラファエル博士。これらの実験は、NHLBI F31 HL128035-01(組織消化プロトコル標準化)、NHLBI 5R01HL117847-02および2P01HL070687-11A1(動物)およびNHLBI 5R01HL117847-02(細胞単離および培養)によって支持された。

Materials

Tissue Dissection
Dissecting Dishes Handmade with Silicone
Culture Petri Dish Pyrex 7740 Glass
Silicone Elastomer Dow Corning Sylgard 170 Kit
Braided Silk Suture Harvard Apparatus 51-7615 SP104
Stereomicroscope MZ6 Leica 10447254
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12562-36
Vannas Scissors George Tiemann & Co 160-150
Splinter Forceps George Tiemann & Co 160-55
Tissue Scissors George Tiemann & Co 105-400
KRBB Solution
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Potassium Chloride Sigma-Aldrich 7447-40-7
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 7758-114
Glucose Sigma-Aldrich 50-99-7
Antibiotic/Antimicotic Corning 30-004-CI
HEPES Corning 25-060-CI
Tissue Digestion
Collagenase Type 1 Worthington Biochemical LS004196
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific 9048-46-8
Red Blood Cell Lysis Buffer BioLegend 420301 1X Working Solution
Water Bath Thermo-Fisher Scientific 2876 Reciprocal Shaking Bath
Biosafety Cabinet Thermo-Fisher Scientific 1385
Rotisserie Incubator Daigger EF4894C
100 µm Cell Strainer Thermo-Fisher Scientific 22-363-549 Yellow
40 µm Cell Strainer Thermo-Fisher Scientific 22-363-547 Blue
Hemocytometer Cole-Parmer UX-79001-00
Trypan Blue Sigma-Aldrich 93595
Cell Isolation
OctoMACS Kit Miltenyi Biotech 130-042-108
(DMEM):F12 Medium Corning 90-090 Medium Base
Fetal Bovine Serum Corning 35016CV USA Origins
Normal Donkey Serum AbCam AB7475
Anti-CD34 Santa Cruz SC-7324 FITC conjugated
Anti-PDGFRα Thermo-Fisher Scientific PA5-17623
Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 712-007-003
PBS 10X Corning 46-013-CM 1X Working Solution
EDTA Fisher Scientific 15575020
Cell Culture
CO2 Cell Incubator Thermo-Fisher Scientific 51030285 Heracell 160i 
6-Well Plates Corning 3516 TC-Treated
48- Well Plates Corning 3548 TC-Treated
96-Well Plates, Black Wall Corning 353376 TC-Treated
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8 TC-Treated
Fetal Calf Serum Corning 35011CV USA Origins
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich 50-81-7
Biotin Sigma-Aldrich 58-85-5
Pantothenate Sigma-Aldrich 137-08-6
L-Glutamine Corning 61-030
Bone Morphogenic Protein 4 Prospec Bio CYT-081
Epidermal Growth Factor PeproTech 400-25
Leukemia Inhibitory Factor PeproTech 250-02
Platelet-derived Growth Factor BB Prospec Bio CYT-740
Basic Fibroblast Growth Factor PeproTech 450-33
Insulin Corning 25-800-CR ITS Solution
IBMX Sigma-Aldrich 28822-58-4
Dexamethasone Sigma-Aldrich 50-02-2
T3 (Triiodothyronine) Sigma-Aldrich 6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Proliferation Assay Thermo-Fisher Scientific C7026
AdipoRed Fluorescence Assay Reagent Lonza PT-7009
Oil Red O Lipid Dye Reagent Sigma-Aldrich O1391 In Solution
M1000 Microplate Reader Tecan
Eclipse Inverted Microscope Nikon
Digital Sight DS-Qil Camera Nikon

References

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Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. J. Vis. Exp. (124), e55818, doi:10.3791/55818 (2017).

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