Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas
Summary
Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).
Abstract
La expansión del tejido adiposo perivascular (PVAT), un regulador principal de la función vascular a través de la señalización paracrina, está directamente relacionada con el desarrollo de la hipertensión durante la obesidad. El grado de hipertrofia e hiperplasia depende de la localización del depósito, el sexo y el tipo de fenotipos de la célula progenitora de los adipocitos (APC) presentes. Las técnicas utilizadas para el aislamiento de APC y preadipocitos en los últimos 10 años han mejorado drásticamente la precisión con la que se pueden identificar células individuales basadas en marcadores de superficie celular específicos. Sin embargo, el aislamiento de APC y adipocitos puede ser un desafío debido a la fragilidad de la célula, especialmente si la célula intacta debe ser retenida para aplicaciones de cultivo celular.
Clasificación de células activadas magnéticamente ( MCS) proporciona un método para aislar mayor número de APC viables por unidad de peso de tejido adiposo. APC cosechado por MCS se puede utilizar para protocolos in vitro para expandir preaDipocitos y los diferencian en adipocitos mediante el uso de cócteles de factores de crecimiento que permiten el análisis del potencial prolífico y adipogénico retenido por las células. Este experimento se centró en los depósitos aórticos y mesentéricos PVAT, que desempeñan un papel clave en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares durante la expansión. Estos protocolos describen métodos para aislar, expandir y diferenciar una población definida de APC. Este protocolo MCS permite que el aislamiento se utilice en cualquier experimento donde la clasificación de células es necesaria con un mínimo de equipo o entrenamiento. Estas técnicas pueden ayudar a experimentos adicionales para determinar la funcionalidad de poblaciones celulares específicas basadas en la presencia de marcadores de superficie celular.
Introduction
El tejido adiposo perivascular (PVAT), debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, es un componente principal de señalización parácrina en la función vascular 1 . La expansión de este tejido adiposo depende del fenotipo de las células progenitoras de adipocitos (APC) presente 2 , 3 . El aislamiento de las células de los tejidos adiposos es difícil ya que los adipocitos primarios son frágiles, flotantes y de tamaño. Ciertas técnicas de aislamiento también pueden alterar el fenotipo celular y la morfología mediante el aumento de la síntesis de proteínas inflamatorias y la reducción de la expresión génica adipogénica 4 , haciendo hincapié en la importancia de un protocolo que mantiene la integridad de las células.
El cultivo de células primarias y subpoblaciones de preadipocitos específicos da un enfoque reduccionista al crecimiento in vivo y mantiene el equivalente genético celular 5 , aunque el trabajo tiMe con estas células se limita debido al deterioro con el envejecimiento, o la senescencia [ 6] . Los preadipocitos de varios depósitos adiposos, incluyendo los depósitos subcutáneos y omentales, también demuestran diferencias en la proliferación 7 , lo que enfatiza la importancia de recoger células de sitios anatómicos específicos. Las células precursoras de depósitos adiposos blancos no PVAT se han caracterizado en estudios previos 7 , 8 , 9 , pero se conoce menos sobre los fenotipos APAT de PVAT.
Las técnicas descritas aquí permiten el análisis de poblaciones de APC específicas y definidas con un impacto mínimo en su morfología, viabilidad y potencial de proliferación y diferenciación. Clasificación de células activadas magnéticamente (MCS) es susceptible a aplicaciones de aguas abajo, tales como cultivo, ya que las perlas se disuelven sin alterar la célula. MCS también es económico, y una vez que el anticuerpo conCentraciones han sido estandarizadas, la necesidad de análisis de citometría de flujo es mínima. Los estudios in vitro con precursores de PVAT también pueden dar una idea del potencial que estas células primarias pueden tener.
Protocol
Representative Results
Discussion
El foco central del presente experimento es el aislamiento, la expansión y la inducción adipogénica de APC a partir de depósitos de PVAT. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de APC basado en la identificación de células que expresan los marcadores de superficie CD34 y PDGFRα. Estas proteínas de superficie se identificaron previamente en APC con altas tasas de proliferación y el potencial para diferenciarse en adipocitos blancos o marrones en varios depósitos adiposos 14 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los Laboratorios Contreras y Watts y el Dr. William Raphael. Estos experimentos fueron apoyados por NHLBI F31 HL128035-01 (estandardización del protocolo de digestión del tejido), NHLBI 5R01HL117847-02 y 2P01HL070687-11A1 (animales), y NHLBI 5R01HL117847-02 (aislamiento celular y cultivo).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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