Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung
Summary
Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).
Abstract
Die Erweiterung des perivaskulären Adipositus (PVAT), ein wichtiger Regulator der Gefäßfunktion durch parakrine Signalisierung, steht in direktem Zusammenhang mit der Entwicklung von Hypertonie bei Adipositas. Das Ausmaß der Hypertrophie und Hyperplasie hängt von der Depotposition, dem Geschlecht und der Art der Adipocyten-Progenitor-Zelle (APC) -Phänotypen ab. Techniken, die für die APC- und Präadipozyten-Isolierung in den letzten 10 Jahren verwendet wurden, haben die Genauigkeit, mit der einzelne Zellen auf der Basis spezifischer Zelloberflächenmarker identifiziert werden können, drastisch verbessert. Allerdings kann die Isolierung von APC und Adipozyten aufgrund der Zerbrechlichkeit der Zelle eine Herausforderung sein, besonders wenn die intakte Zelle für Zellkulturanwendungen erhalten bleiben muss.
Magnetisch aktivierte Zellsortierung ( MCS) stellt eine Methode zur Isolierung einer größeren Anzahl von lebensfähigen APC pro Gewichtseinheit von Fettgewebe zur Verfügung. APC, das von MCS geerntet wird, kann für in vitro Protokolle verwendet werden, um prea zu erweiternDipozyten und differenzieren sie in Adipozyten durch Verwendung von Wachstumsfaktor-Cocktails, die die Analyse des produktiven und adipogenen Potentials ermöglichen, das von den Zellen zurückgehalten wird. Dieses Experiment konzentrierte sich auf die Aorten- und Mesenterial-PVAT-Depots, die bei der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei der Expansion eine Schlüsselrolle spielen. Diese Protokolle beschreiben Methoden zur Isolierung, Erweiterung und Differenzierung einer definierten Population von APC. Dieses MCS-Protokoll ermöglicht die Isolierung in jedem Experiment, wo Zellsortierung mit minimaler Ausrüstung oder Training erforderlich ist. Diese Techniken können weitere Experimente unterstützen, um die Funktionalität bestimmter Zellpopulationen basierend auf der Anwesenheit von Zelloberflächenmarkern zu bestimmen.
Introduction
Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) ist aufgrund seiner Nähe zu den Blutgefäßen eine wichtige Parakrin-Signalisierungskomponente in der Gefäßfunktion 1 . Die Erweiterung dieses Fettgewebes hängt vom Phänotyp der Adipocyten-Progenitor-Zellen (APC) 2 , 3 ab . Die Isolierung von Zellen aus adipösen Geweben ist schwierig, da primäre Adipozyten zerbrechlich, schwimmfähig und reich an Größe sind. Bestimmte Isolationstechniken können auch den Zellphänotyp und die Morphologie verändern, indem sie die entzündliche Proteinsynthese erhöhen und die adipogene Genexpression 4 reduzieren und die Bedeutung eines Protokolls hervorheben, das die Integrität der Zellen beibehält.
Die Kultur der Primärzellen und der spezifischen Präadipozyten-Subpopulationen ergibt einen reduktionistischen Ansatz für das Wachstum von In-vivo und behält das äquivalente zelluläre genetische Make-up 5 beiMich mit diesen Zellen ist begrenzt wegen der Verschlechterung mit Alterung oder Seneszenz 6 . Präadipozyten aus verschiedenen adipösen Depots, einschließlich subkutaner und omentaler Depots, zeigen auch Unterschiede in der Proliferation 7 , was die Bedeutung des Sammelns von Zellen aus spezifischen anatomischen Stellen hervorhebt. Vorläuferzellen aus nicht-PVAT-weißen adipösen Depots wurden in früheren Studien 7 , 8 , 9 charakterisiert, aber weniger ist bekannt über PVAT APC-Phänotypen.
Die hier beschriebenen Techniken erlauben die Analyse spezifischer und definierter APC-Populationen mit minimaler Auswirkung auf ihre Morphologie, ihre Lebensfähigkeit und ihr Potenzial zur Proliferation und Differenzierung. Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MCS) ist nachgeschalteten Anwendungen wie Kultur möglich, da sich die Kügelchen auflösen, ohne die Zelle zu verändern. MCS ist auch ökonomisch, und sobald der Antikörper conKonzentrationen wurden standardisiert, die Notwendigkeit für Durchflusszytometrie-Assays ist minimal. In-vitro- Studien mit PVAT-Vorläufern können auch einen Einblick in das Potenzial geben, das diese Primärzellen haben können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Mittelpunkt des vorliegenden Experiments steht die Isolierung, Expansion und adipogene Induktion von APC aus PVAT-Depots. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von APC vor, das auf der Identifizierung von Zellen basiert, die die Oberflächenmarker CD34 und PDGFRα exprimieren. Diese Oberflächenproteine wurden zuvor auf APC mit hohen Proliferationsraten und dem Potential identifiziert, in weiße oder braune Adipozyten in verschiedenen adipösen Depots 14 , <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Contreras und Watts Laboratories und Dr. William Raphael. Diese Experimente wurden von NHLBI F31 HL128035-01 (Gewebeverdauungsprotokoll-Standardisierung), NHLBI 5R01HL117847-02 und 2P01HL070687-11A1 (Tiere) und NHLBI 5R01HL117847-02 (Zellisolation und Kultur) unterstützt.
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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