التوسع و أديبوجينيسيس تحريض الأسلاف خلية شحمية من الأنسجة الدهنية حول الأوعية معزولة من قبل المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز
Summary
هنا نحن تقرير طريقة لعزل الخلايا خلية خلية خلية (أبك) من الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات) باستخدام المغناطيسي تنشيط الخلايا فرز (مكس). هذا الأسلوب يسمح لزيادة عزل أبك لكل غرام من الأنسجة الدهنية بالمقارنة مع مضان تنشيط الخلايا الفرز (فاكس).
Abstract
توسع الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات)، وهو منظم رئيسي لوظيفة الأوعية الدموية من خلال الإشارات باراكرين، يرتبط ارتباطا مباشرا بتطور ارتفاع ضغط الدم أثناء السمنة. مدى تضخم وتضخم يعتمد على موقع مستودع، والجنس، ونوع من الخلايا السليفة خلية خلية (أبك) الظواهر الحالية. التقنيات المستخدمة ل أبك و برياديبوسيتس العزلة في السنوات ال 10 الماضية قد تحسنت بشكل كبير في دقة الخلايا الفردية التي يمكن تحديدها على أساس محدد علامات سطح الخلية. ومع ذلك، فإن عزل أبك والشحميات يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة الخلية، وخاصة إذا كان يجب الاحتفاظ الخلية سليمة لتطبيقات زراعة الخلايا.
يوفر تنشيط الخلايا المغناطيسي ( مكس) طريقة لعزل عدد أكبر من أبك قابلة للحياة في وحدة الوزن من الأنسجة الدهنية. أبك تحصدها مكس يمكن استخدامها لبروتوكولات في المختبر لتوسيع برياديبوسيتس والتفريق بينها في الخلايا الشحمية من خلال استخدام الكوكتيلات عامل النمو مما يسمح لتحليل إمكانات غزير و أديبوجينيك الاحتفاظ بها من قبل الخلايا. وركزت هذه التجربة على المستودعات الباطنية المساريقية الأبهرية، والتي تلعب أدوارا رئيسية في تطوير أمراض القلب والأوعية الدموية أثناء التوسع. تصف هذه البروتوكولات طرق لعزل، توسيع، وتمييز مجموعة محددة من أبك. هذا البروتوكول مكس يسمح العزلة لاستخدامها في أي تجربة حيث الفرز الخلية هو مطلوب مع الحد الأدنى من المعدات أو التدريب. هذه التقنيات يمكن أن تساعد المزيد من التجارب لتحديد وظائف السكان خلية محددة على أساس وجود علامات سطح الخلية.
Introduction
الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات)، نظرا لقربها من الأوعية الدموية، هو عنصر باراكرين إشارة رئيسية في وظيفة الأوعية الدموية 1 . التوسع في هذا النسيج الدهني يعتمد على النمط الظاهري للخلايا خلية الخلايا الشحمية (أبك) الحاضر 2 ، 3 . عزل الخلايا من الأنسجة الدهنية أمر صعب كما الخلايا الشحمية الأولية هشة، مزدهرة، ومدى في الحجم. بعض تقنيات العزلة يمكن أيضا تغيير النمط الظاهري الخلية والمورفولوجيا عن طريق زيادة تخليق البروتين الالتهابي والحد من التعبير الجيني أديبوجينيك 4 ، مؤكدا على أهمية بروتوكول يحافظ على سلامة الخلايا.
ثقافة الخلايا الأولية والقطاعات الفرعية برياديبوسيت محددة يعطي نهج الاختزال في نمو الجسم الحي ويحافظ على ما يعادل التركيب الخلوي الخلوي 5 ، على الرغم من أن العمل تيلي مع هذه الخلايا محدودة بسبب تدهور مع الشيخوخة، أو الشيخوخة 6 . وتظهر الخلايا المسبقة من المستودعات الدهنية المختلفة، بما في ذلك المستودعات تحت الجلد والمستودعات، اختلافات في الانتشار 7 ، مما يؤكد أهمية جمع الخلايا من مواقع تشريحية محددة. وقد اتسمت الخلايا السلائف من غير بفات مستودعات الدهنية البيضاء في الدراسات السابقة 7 ، 8 ، 9 ، ولكن أقل هو معروف عن المظاهر بفات أبك.
التقنيات الموصوفة هنا تسمح لتحليل السكان محددة ومحددة أبك مع تأثير ضئيل على مورفولوجيا، وقابلية البقاء، وإمكانية التكاثر والتمييز. تصنيف الخلايا المغناطيسية تنشيط (مكس) هو قابل للتطبيقات المصب، مثل الثقافة، وحبات تذوب دون تغيير الخلية. مكس هو أيضا اقتصادية، وبمجرد أن يخدع الأجسام المضادةوقد تم توحيد الترآيزات، والحاجة إلى المقايسات التدفق الخلوي هو الحد الأدنى. في الدراسات المختبرية مع السلائف بفات يمكن أيضا إعطاء لمحة عن احتمال أن هذه الخلايا الأولية قد يكون.
Protocol
Representative Results
Discussion
التركيز الرئيسي من التجربة الحالية هو العزلة، والتوسع، وتحريض أديبوجينيك من أبك من مستودعات بفات. هنا نقدم بروتوكول لعزل أبك على أساس تحديد الخلايا معربا عن علامات سطح CD34 و PDGFRα. تم تحديد هذه البروتينات السطحية سابقا على أبك مع معدلات انتشار عالية وإمكانية التفريق إ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
و كونتريراس و واتس المختبرات والدكتور ويليام رفائيل. وقد دعمت هذه التجارب من قبل نهلبي F31 HL128035-01 (الأنسجة بروتوكول الهضم التوحيد)، نهلبي 5R01HL117847-02 و 2 P01HL070687-11A1 (الحيوانات)، و نهلبي 5R01HL117847-02 (عزل الخلية والثقافة).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
