フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の実質組織に存在するマクロファージである。それらは2つの重要な機能的役割を果たします：免疫防御およびCNSホメオスタシスの維持。骨髄の造血幹細胞から絶えず更新されているMDMとは対照的に、ミクログリア細胞は、胚発生の間に脳に定着した卵黄嚢（YS）に由来する原始造血前駆細胞から分化する^1,2,3 。げっ歯類では、転写因子Mybは、骨髄由来の単球およびマクロファージのすべての発生に重要な役割を果たすが、YS由来のミクログリアについては、この因子は不可欠であり、分化は転写因子PU.14に依存する。

健康な中枢神経系において、ミクログリアは、絶えず彼らの環境をスクリーニングする動的細胞である侵入する病原体または組織の損傷のための巣作りおよび調査⁵ 。そのようなシグナルの検出は、傷害を解決するための経路を開始する。ミクログリアは、急速に形態を変化させてアメイボイドに転換し、続いて食作用および炎症性サイトカインなどの様々なメディエーターの貪食および放出が起こる。したがって、それらの微小環境に依存して、活性化ミクログリアは、異なるプライミング状態のスペクトルを獲得することができる⁶ 。

ミクログリアは、多くの神経障害の発症および進行に深く影響する。アルツハイマー病（AD） ⁷ 、筋萎縮性側索硬化症（ALS） ⁸ 、多発性硬化症（MS） ⁹またはパーキンソン病（PD） ¹⁰のげっ歯類モデルにおいて、ミクログリアは有害な神経毒性を誘発するか、神経保護的な様式で、これは依存性である特定の疾患、病期、およびその病気が全身性免疫コンパートメント7,8,9,10,11の影響を受けているかどうかを判定した。上記の疾患において観察されるCNS病変の大部分は、実質性小膠細胞だけでなく、血管周囲および髄膜マクロファージならびにCNS浸潤性MDMを含む骨髄系細胞の異種集団を含む。これらの細胞型は、傷害および修復に関連する病態生理学的機構に示差的に寄与する可能性がある7,12,13,14,15。これらの疾患モデルを研究している研究者の現在の課題は、末梢単球およびマクロファージがCNSに浸潤するかどうかを確かめることであり、そうであれば、distこれらの細胞から常在性小膠細胞を摘出する。実際、小膠細胞は非常に塑性である。それらが活性化されると、ミクログリアは、通常、末梢単球およびマクロファージによって発現されるマーカーを再発現する。従って、この問題は、常在ミクログリアを浸潤単球およびマクロファージから区別することができるマーカーを同定することに依存する。

免疫組織学的適用による脳切片上のこれらの集団の識別は、特異的抗体の欠如のために制限される。しかし、フローサイトメトリー分析は、いくつかのマーカーの発現を評価し、細胞集団（例えば、リンパ球、マクロファージ/ MDM CD11b ⁺ CD45 ^high 、およびミクログリアCD11b ⁺ CD45 ^med ）ならびに細胞亜集団^{16 、 17,18} 。このプロトコルは、最適化された酵素組織解離および密度勾配遠心分離を用いることによって神経疾患モデルにおいてマウスCNS由来の単核細胞を単離すること;ならびにフローサイトメトリーを用いてCNS中のミクログリアおよびMDM集団を識別するための方法を提供する。

別のアプローチは、特定の抗体19,20,21にコンジュゲートした磁気ビーズを使用することによってミエリンを除去し、細胞を精製することである。抗ミエリン磁気ビーズを使用するミエリン除去は、より高価であり、単離された細胞^22の生存率および収量に影響を及ぼす。この段階およびミクログリアの以下の免疫磁気分離は、特定の免疫細胞集団のさらなる研究を制限する^21,22 。

これらの手順は、疾患発症におけるマクロファージ亜集団を研究する簡単な方法を提供し、マクロファージの表現型および活性化状態における薬物効果または遺伝子修飾を決定する。