Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário ^{1 , 2 , 3} . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 ⁴ .

No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos ⁵ . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos ⁶ .

A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) ⁷ , esclerose lateral amiotrófica (ALS) ⁸ , esclerose múltipla (MS) ⁹ ou doença de Parkinson (PD) ¹⁰ , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação ^{7 , 12 , 13 , 14 , 15} . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes.

A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b ⁺ CD45 ^alto e microglia CD11b ⁺ CD45 ^med ), bem como subpopulações celulares ^{16 , 17 , 18} . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo.

Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos ^{19 , 20 , 21} . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas ²² . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes ^{21 , 22} .

Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.