Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario ^{1 , 2 , 3} . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 ⁴ .

En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular ⁵ . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ ^6] .

La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) ⁷ , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ⁸ , la esclerosis múltiple (EM) ⁹ o la enfermedad de Parkinson (PD) ¹⁰ , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación ^{7 , 12 , 13 , 14 , 15} . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos.

La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b ⁺ CD45 ^alto y microglia CD11b ⁺ CD45 ^med ), así como las subpoblaciones celulares ^{16 , 17 , 18} . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo.

Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos ^{19 , 20 , 21} . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ ^22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes ^{21 , 22} .

Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.