Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Die Mikroglia sind die parenchymalen Gewebe-residenten Makrophagen des Zentralnervensystems (ZNS). Sie spielen zwei wichtige Funktionsrollen: Immunabwehr und Wartung der ZNS-Homöostase. Im Gegensatz zu den MDM, die kontinuierlich aus den hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark erneuert werden, unterscheiden sich die Mikrogliazellen von primitiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Dottersack (YS), die das Gehirn während der embryonalen Entwicklung ^{1 , 2 , 3} kolonisierten. Bei Nagetieren spielt der Transkriptionsfaktor Myb eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung aller von Knochenmark abgeleiteten Monozyten und Makrophagen, aber für YS-abgeleitete Mikroglia ist dieser Faktor entbehrlich und die Differenzierung bleibt abhängig vom Transkriptionsfaktor PU.1 ⁴ .

Im gesunden ZNS sind Mikroglia dynamische Zellen, die ständig ihre Umgebung abtasten, scaNning und Vermessung zum Eindringen von Krankheitserregern oder Gewebeschäden ⁵ . Die Erkennung solcher Signale leitet einen Weg ein, um die Verletzung zu lösen. Die Mikroglia wechselt schnell von einer verzweigten Morphologie zu einer amöboiden, die von Phagozytose und Freisetzung verschiedener Mediatoren wie pro- oder entzündungshemmenden Zytokinen gefolgt wird. So kann abhängig von ihrer Mikroumgebung aktivierte Mikroglia ein Spektrum unterschiedlicher Priming-Zustände ⁶ erwerben.

Die Mikroglia beeinflusst die Entwicklung und den Fortschritt vieler neurologischer Erkrankungen. Bei den Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit (AD) ⁷ , der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) ⁸ , der Multiple Sklerose (MS) ⁹ oder der Parkinson-Krankheit (PD) ^{10 wird gezeigt} , dass die Mikroglia eine doppelte Rolle spielt, die entweder eine nachteilige Neurotoxizität oder eine wirksame Wirkung hervorruft In einer neuroprotektiven Weise, die abhängig ist oN die spezifische Krankheit, das Krankheitsstadium und ob die Krankheit durch das systemische Immunabteil ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 beeinflusst wurde} . Die meisten der in den oben genannten Krankheiten beobachteten ZNS-Läsionen enthalten eine heterogene Population von myeloiden Zellen, darunter nicht nur parenchymale Mikroglia, sondern auch perivaskuläre und meningeale Makrophagen sowie CNS-infiltrierende MDM. Diese Zelltypen können unterschiedlich zu den pathophysiologischen Mechanismen beitragen, die sich auf Verletzungen und Reparaturen beziehen ^{7 , 12 , 13 , 14 , 15} . Die gegenwärtige Herausforderung für Forscher, die diese Krankheitsmodelle studieren, besteht darin, festzustellen, ob die peripheren Monozyten und Makrophagen das ZNS infiltrieren und wenn ja, in distLegen Sie die residenten Mikroglia aus diesen Zellen. In der Tat sind die Mikrogliazellen sehr plastisch; Wenn sie aktiviert sind, werden die Mikroglia-Marker, die üblicherweise durch periphere Monozyten und Makrophagen exprimiert werden, erneut exprimieren. Das Problem beruht daher auf der Identifizierung von Markern, die die residenten Mikroglia von den infiltrierenden Monozyten und Makrophagen unterscheiden können.

Die Diskriminierung dieser Populationen auf Gehirnscheiben durch immunhistologische Anwendungen ist aufgrund des Fehlens spezifischer Antikörper begrenzt. Die Durchflusszytometrieanalyse ist jedoch eine effiziente Technik zur Beurteilung der Expression mehrerer Marker und zur Unterscheidung von Zellpopulationen (z. B. Lymphozyten, Makrophagen / MDM CD11b ⁺ CD45 ^hoch und Microglia CD11b ⁺ CD45 ^med ) sowie Zellsubpopulationen ^{16 , 17 , 18} Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Isolierung derMononukleare Zellen aus dem Maus-ZNS in neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung einer optimierten, enzymatischen Gewebe-Dissoziation und einer Dichtegradienten-Zentrifugation; Sowie ein Verfahren zur Differenzierung der Mikroglia- und MDM-Populationen im ZNS durch Durchflusszytometrie.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, das Myelin zu eliminieren und die Zellen unter Verwendung von magnetischen Perlen zu reinigen, die mit spezifischen Antikörpern ^{19 , 20 , 21} konjugiert sind. Die Myelinentfernung unter Verwendung von Anti-Myelin-Magnetperlen ist teurer und beeinflusst die Lebensfähigkeit und die Ausbeute an isolierten Zellen ²² . Dieser Schritt und die folgende immunomagnetische Trennung der Mikroglia, beschränken weitere Untersuchungen der spezifischen Immunzellpopulationen ^{21 , 22} .

Diese Verfahren bieten eine einfache Möglichkeit, die Makrophagen-Subpopulationen in der Krankheitsentwicklung zu untersuchen undUm die Arzneimittelwirkungen oder Genmodifikationen auf Makrophagen-Phänotypen und Aktivierungszuständen zu bestimmen.