Summary

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em> Rhipicephalus microplus</em> Células epiteliales intestinales

Published: July 23, 2017
doi:

Summary

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

Abstract

Rhipicephalus microplus es el ectoparásito más significativo en términos de impacto económico en el ganado como vector de varios patógenos. Se han dedicado esfuerzos al control de garrapatas para disminuir sus efectos deletéreos, centrándose en el descubrimiento de vacunas candidatas, como la BM86, localizada en la superficie de las células epiteliales de la garrapata. La investigación actual se centra en la utilización de cDNA y bibliotecas genómicas, para seleccionar otras vacunas candidatas. El aislamiento de las células intestinales de garrapatas constituye una ventaja importante en la investigación de la composición de las proteínas de superficie sobre la membrana de las células del intestino de garrapatas. Este trabajo constituye un método novedoso y factible para el aislamiento de células epiteliales, a partir de los contenidos de intestino de garrapata de R. microplus. Este protocolo utiliza TCEP y EDTA para liberar las células epiteliales de los tejidos de soporte subepiteliales y un gradiente de densidad discontinua gradieNt para separar las células epiteliales de otros tipos de células. Las proteínas de la superficie celular fueron biotiniladas y aisladas de las células epiteliales de la tripa de la garrapata, usando perlas magnéticas unidas a estreptavidina permitiendo aplicaciones posteriores en análisis FACS o LC-MS / MS.

Introduction

Rhipicephalus microplus es la ectoparásita más significativa en términos de impacto económico en la industria ganadera de las regiones tropicales y subtropicales, ya que vectores de la fiebre de la garrapata bovina (babesiosis), la anaplasmosis y la piroplasmosis equina 1 , 2 , 3 , 4 . Sin embargo, los métodos convencionales como el uso de acaricidas químicos tienen inconvenientes implícitos, como la presencia de residuos químicos en la leche y la carne, y el aumento de la prevalencia de garrapatas químicamente resistentes 5 , 6 , 7 . En consecuencia, se ha estudiado el desarrollo de métodos alternativos de control de garrapatas, como el uso de resistencia natural bovina, el control biológico (biopesticidas) y la vacunaInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

En la búsqueda de proteínas capaces de ser utilizadas como vacunas candidatas, la investigación actual se centra en la garrapata intestinal. La pared del intestino medio se construye a partir de una sola capa de células epiteliales descansando sobre una fina lámina basal, con el exterior de la lámina basal formando una red de músculos. Las observaciones del microscopio electrónico y de luz indican que el intestino medio consiste en tres tipos de células: reserva (indiferenciada), secretora y digestiva. El número de tipos de células varía considerablemente dependiendo de la fase fisiológica. Las células secretoras y digestivas proceden de células de reserva 18 , 19 , 20 .

La construcción de bibliotecas de cDNAPara examinar la composición de la tripa de la garrapata ha llevado a la identificación de proteínas antigénicas, como Bm86, como potencial vacuna candidatos 2 , 3 , 4 . La glicoproteína Bm86 se localiza en la superficie de las células de la garrapata e induce una respuesta inmune protectora contra la garrapata del ganado vacuno ( R. microplus ). Las IgG anti-Bm86 producidas por el huésped inmunizado son ingeridas por la garrapata, reconocen este antígeno en la superficie de las células del intestino de garrapatas y, posteriormente, alteran la función e integridad del tejido del intestino de garrapata. Las vacunas basadas en antígenos Bm86 han mostrado un control efectivo de R. microplus y Rhipicephalus annulatus, al reducir el número, el peso y la capacidad reproductora de las hembras engorciadoras, lo que resulta en una infestación larval reducida en las generaciones subsiguientes de garrapatas 4 . Sin embargo, las vacunas basadas en Bm86 no son eficaces contra todas lasDemostró una eficacia insatisfactoria frente a algunas cepas geográficas de R. microplus , por lo que las industrias lecheras y de vacuno han adoptado mal estas vacunas 2 , 4 .

La capacidad de aislar las células epiteliales de la tripa de la garrapata es una innovación significativa que permitiría la progresión de la investigación para determinar la composición de la membrana de proteínas, incluyendo la morfología y la fisiología en diferentes condiciones ambientales. El método aquí descrito utiliza el agente quelante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el agente reductor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para liberar el epitelio de sus tejidos de soporte subepitelial 10 . El epitelio se recupera tras la interrupción mecánica de los tejidos por agitación, seguido de centrifugación discontinua en gradiente en Percoll. Este artículo describe una técnica factible y novedosa para el aislamiento de la epi de garrapatasLas células celulares. Las proteínas de superficie celular biotiniladas, aisladas de la superficie de estas células epiteliales pueden analizarse subsiguientemente en aplicaciones aguas abajo tales como análisis FACS y / o LC-MS / MS.

Protocol

1. Disección del epitelio intestinal de R. microplus Recoger las garrapatas semi-engorged de ganado en el día del experimento. Diseccionar las garrapatas dentro de las 24 h después de la remoción del huésped. Adhiera una tira de cinta adhesiva al fondo de la placa de Petri de 92 mm x 16 mm. Añadir una gota de super pegamento a la cinta. Coloque la garrapata, lado ventral hacia abajo sobre el super pegamento, deje que se seque durante 2 min. Verter 100 ml de sol…

Representative Results

Se aislaron células epiteliales de los tejidos intestinales de R. microplus según el esquema presentado en la Figura 1 . Las imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de las células epiteliales de la tripa de la garrapata preparadas usando este protocolo se muestran en la Figura 2A Y 2B. Como el aislamiento celular se realiza s…

Discussion

Las infestaciones de garrapatas de ganado constituyen un problema importante para la industria ganadera en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, con el método de control más común dependiente del uso de acaricidas 1 , 4 . Bm86 fue identificado previamente dentro de la superficie epitelial del intestino de garrapata como un antígeno protector contra la infestación de R. microplus 10 , con …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a la Colonia Tick de Bioseguridad (Departamento de Agricultura y Pesca de Queensland, Australia) por la provisión de garrapatas Rhipicephalus microplus utilizadas para este estudio, y Lucas Karbanowicz para asistencia con filmación de video.

Materials

0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM – ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont – Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue – Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

References

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Cite This Article
Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

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