Summary

Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от<em> Ripicephalus microplus</em> Эпителиальные кишечные клетки

Published: July 23, 2017
doi:

Summary

Методика, основанная на модифицированном градиенте плотности центрифугирования, была использована для выделения эпителиальных клеток из ткани кишечника Ripicephalus microplus . Поверхностные белки биотинилировали и очищали с помощью стрептовидиновых магнитных гранул для использования в нисходящих приложениях.

Abstract

Rhipicephalus microplus – клещ крупного рогатого скота – является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на скот в качестве вектора нескольких патогенов. Усилия были направлены на контроль клеща крупного рогатого скота, чтобы уменьшить его пагубные последствия, с упором на открытие кандидатов на вакцины, таких как BM86, расположенных на поверхности эпителиальных клеток кишечника. В текущих исследованиях основное внимание уделяется использованию кДНК и геномных библиотек для скрининга других кандидатов на вакцины. Выделение клеток клещей кишки является важным преимуществом при исследовании состава поверхностных белков на мембране клеток клещей. Эта статья представляет собой новый и осуществимый метод выделения эпителиальных клеток, из содержимого кишечника в виде полупоглощенного R. microplus. В этом протоколе используются TCEP и EDTA для высвобождения эпителиальных клеток из субэпителиальных опорных тканей и градиента дискретной плотности центрифугированияNt для отделения эпителиальных клеток от других типов клеток. Белки клеточной поверхности были биотинилированы и выделены из эпителиальных клеток тикового кишечника, используя магнитные гранулы, связанные с стрептавидином, что позволяет использовать последующие приложения в FACS или LC-MS / MS-анализе.

Introduction

Rhipicephalus microplus , крупный рогатый скот, является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на крупный рогатый скот в тропических и субтропических регионах, поскольку он переносит лихорадку крупного рогатого скота (бабезиоз), анаплазмоз и конский пироплазмоз 1 , 2 , 3 , 4 . Усилия были направлены на контроль крупного рогатого скота, чтобы уменьшить пагубный эффект, однако обычные методы, такие как использование химических акарицидов, имеют скрытые недостатки, такие как наличие химических остатков в молоке и мясе, а также увеличение распространенности химически устойчивых клещей 5 , 6 , 7 . Следовательно, были изучены разработки альтернативных методов контроля тика, такие как использование натурального скота, биологический контроль (биопестициды) и вакцинация4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .

В погоне за белками, которые могут быть использованы в качестве кандидатов на вакцины, текущие исследования сосредоточены на кишке. Стена средней кишки построена из одного слоя эпителиальных клеток, опирающегося на тонкую базальную пластинку, а наружная базальная пластинка образует сеть мышц. Наблюдения света и электронного микроскопа показывают, что средняя кишка состоит из трех типов клеток: резервной (недифференцированной), секреторной и пищеварительной. Количество типов клеток значительно варьируется в зависимости от физиологической фазы. Секреторные и пищеварительные клетки происходят из резервных клеток 18 , 19 , 20 .

Построение библиотек кДНКДля изучения состава клещей кишки привело к идентификации антигенных белков, таких как Bm86, в качестве потенциальных кандидатов вакцины 2 , 3 , 4 . Гликопротеин Bm86 локализуется на поверхности клеток кишечника клещей и индуцирует защитный иммунный ответ против клеща крупного рогатого скота ( R. microplus ) у вакцинированного крупного рогатого скота. Анти-Bm86 IgG, продуцируемые иммунизированным хозяином, проглатываются клещей, распознают этот антиген на поверхности клеток кишечника клеща и впоследствии нарушают функцию и целостность ткани кишечника. Вакцины, основанные на антигенах Bm86, показали эффективный контроль R. microplus и Rhipicephalus annulatus за счет сокращения числа, веса и репродуктивной способности сыпучих самок, что привело к снижению личиночной инвазии в последующих клеточных поколениях 4 . Однако вакцины на основе Bm86 не эффективны против всех этапов тика и имеютПродемонстрировали неудовлетворительную эффективность против некоторых географических штаммов R. microplus , поэтому говядина и молочная промышленность плохо приняли эти вакцины 2 , 4 .

Способность изолировать эпителиальные клетки от клещей кишечника является важным новшеством, которое позволило бы прогрессировать исследования для определения состава белковой мембраны, включая морфологию и физиологию в различных условиях окружающей среды. Описанный здесь способ использует хелатирующий агент этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и восстановитель трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) для высвобождения эпителия из его субэпителиальных поддерживающих тканей 10 . Эпителий восстанавливается после механического разрушения тканей путем встряхивания с последующим центрифугированием с разрывом градиента в Percoll. В этой статье описывается возможный и новый метод изоляции клещей кишечника epiТеалиальные клетки. Биотинилированные клеточные поверхностные белки, выделенные с поверхности этих эпителиальных клеток, могут впоследствии анализироваться в нисходящих приложениях, таких как FACS и / или LC-MS / MS-анализ.

Protocol

1. Рассечение кишечного эпителия от R. microplus Собирайте полупоглощенные клещи от крупного рогатого скота в день эксперимента. Просеивать тики в течение 24 часов после удаления с хозяина. Прикрепите полоску клейкой ленты к нижней части чашки Петри размером 92 мм x 16 мм…

Representative Results

Эпителиальные клетки были выделены из тканей кишечника R. microplus в соответствии с схемой, представленной на рисунке 1 . Репрезентативные снимки флуоресцентной микроскопии эпителиальных клеток кишечника, полученные с использованием этог?…

Discussion

Население крупного рогатого скота представляет собой серьезную проблему для крупного рогатого скота в тропических и субтропических регионах мира, причем наиболее распространенный метод контроля зависит от использования акарицидов 1 , 4 . Bm86 ранее был и?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить биозащищенности Tick колонию (Квинсленд Департамент сельского хозяйства и рыболовство, Австралия) для предоставления Rhipicephalus MicroPlus клещи , используемой для данного исследования, и Лукас Karbanowicz за помощью видеосъемки.

Materials

0.4% Trypan Blue ThermoFisher Scientific 15250061
1.5 mL microcentrifuge tube Eppendorf 3322
100mM Carbonate Buffer 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6
16 mL centrifuge tubes with sealing cap Thermo Scientific 3138-0016 Cool in ice prior to gradient
250 µM cell strainer Thermo Fisher 87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA Sigma T0440 Stored at 4C
30% Hydrogen Peroxide Labscene BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel Gen Script M42015
4-Chloro-1-naphthol tablet Sigma-Aldrich C6788
50 mL Falcon Tube Corning Blue 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.
70 µM cell strainer BD Falcon 352350
AP15 filter paper Millipore AO1504200
Biotin (Type A) Conjugation Kit Abcam Ab102865
Dissection microscope Olympus SZX7
DP Manager  Olympus 2.2.1.195 Cell imagery software
Duct Tape Home Handyman 48mm x 25mm Duct Tape
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 DMEM – ice cold for protocol
EDTA Amresco 0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate Nunc 439454
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12003C FCS
Fluorescence microscope   Olympus  BX51
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI
Forceps Dumont #9 Dumont – Switerzland
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 Glycerol for molecular biology >99%
Glycine Sigma-Aldrich 410225
Hand-Held Counter Officeworks JA0376230
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Life Sciences H9394 HBSS – ice cold for protocol
Hemacytometer Optik Lakor
L-Glutathione oxidized Sigma-Aldrich G4376
Magnetic Separation Stand Novagen 4-Tube Magnetic Separation Rack
Methanol Sigma-Aldrich 179337
Milli-Q Water Millipore ZRXQ003WW Integral Water Purification System for Ultrapure Water
Nitrocellulose Membrane Life Sciences 66485 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane
PageRuler Prestained protein Ladder Thermo-Fisher SM0671
PBS 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4
Percoll Sigma-Aldrich P1644-500ML
Peristaltic Pump Masterflex 7518-10
Phosphoric Acid Sigma-Aldrich P6560
Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer Thermo-Scientific 37573 Stored at 4C. Blocking Buffer
Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8215-5ML PIC – stored at -20 °C
Quick Start Bradford Dye Reagent 1x Biorad 500-0205 For Bradford Assay
Quick Start BSA Standards Biorad 500-0207 BSA standards for Bradford Assay
Scalpel Lab. Co Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Staining Kit Invitrogen LC6070
Simply Blue TM Safe Stain  Invitrogen LC6060
Sorvall C6+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 46910
Streptavidin (HRP) Abcam AB7403
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S
Super Glue – Ultra Fast Mini UHU UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini
Table-top Centrifuge Eppendorf 22331
TCEP Thermo Fisher 20490
Triton X-100 Biorad 161-0407
Tween-20 Sigma P2287-500ML
Vortex Mixer Ratek VM1
Water Bath Grant GD100

References

  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
  3. García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
  4. Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
  5. Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
  6. Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
  7. Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
  8. Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
  9. Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
  10. Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
  11. Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
  12. Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
  13. Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
  14. Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
  15. Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
  16. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
  17. Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
  18. Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
  19. Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks&#34. 1, (2014).
  20. Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure&#34 (English Translation). , (1983).

Play Video

Cite This Article
Karbanowicz, T. P., Lew-Tabor, A., Rodriguez Valle, M. Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells. J. Vis. Exp. (125), e55747, doi:10.3791/55747 (2017).

View Video