Purificação de proteínas de superfície de células biotiniladas de<em> Rhipicephalus microplus</em> Células intestinais epiteliais

Rhipicephalus microplus , o carrapato do gado, é o ectoparasito mais significativo em termos de impacto econômico na indústria pecuária de regiões tropicais e subtropicais, na medida em que eleva a febre do carrapato bovino (babesiose), anaplasmose e piroplasmose equina ^{1 , 2 , 3 , 4} . Os esforços foram dedicados ao controle do carrapato do gado, para diminuir o efeito deletério, no entanto, os métodos convencionais, como o uso de acaricidas químicos, apresentam desvantagens implícitas, como a presença de resíduos químicos no leite e a carne e o aumento da prevalência de carrapatos quimicamente resistentes ^{5 , 6 , 7} . Conseqüentemente, o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de tiquetaque foi estudado, como o uso de bovinos de resistência natural, controle biológico (biopesticidas) e vacinaInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Na busca de proteínas capazes de serem utilizadas como vacinas candidatas, a pesquisa atual é focada no intestino do carrapato. A parede do intestino médio é construída a partir de uma única camada de células epiteliais descansando sobre uma lâmina basal fina, com a parte externa da lâmina basal formando uma rede de músculo. As observações de luz e microscópio eletrônico indicam que o intestino médio consiste de três tipos de células: reserva (indiferenciada), secreção e digestivo. O número de tipos de células varia consideravelmente dependendo da fase fisiológica. As células secretoras e digestivas originam-se das células de reserva ^{18 , 19 , 20} .

A construção de bibliotecas de cDNAPara examinar a composição do intestino do carrapato levou à identificação de proteínas antigênicas, como o Bm86, como potenciais candidatos à vacina ^{2 , 3 , 4} . A glicoproteína Bm86 está localizada na superfície das células intestinais do carrapato e induz uma resposta imune protetora contra o carrapato do gado ( R. microplus ) no gado vacinado. As IgG anti-Bm86 produzidas pelo hospedeiro imunizado são ingeridas pelo carrapato, reconhecem este antígeno na superfície das células intestinais do carrapato e, posteriormente, perturbam a função e integridade do tecido intestinal. As vacinas baseadas em antígenos Bm86 mostraram controle efetivo de R. microplus e Rhipicephalus annulatus, reduzindo o número, peso e capacidade reprodutiva das fêmeas envolventes, resultando em uma infestação larval reduzida nas gerações subseqüentes do carrapato ⁴ . No entanto, as vacinas baseadas em Bm86 não são eficazes contra todos os estádios de carrapatos e têmDemonstraram eficácia insatisfatória contra algumas cepas geográficas de R. microplus , conseqüentemente as indústrias de carne bovina e láctea adotam mal estas vacinas ^{2 , 4} .

A capacidade de isolar células epiteliais do intestino do carrapato é uma inovação significativa que permitiria a progressão da pesquisa para determinar a composição da membrana protéica, incluindo morfologia e fisiologia sob diferentes condições ambientais. O método aqui descrito utiliza o agente de quelação de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o agente redutor tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) para libertar o epitélio dos seus tecidos de suporte subepitelial ¹⁰ . O epitélio é recuperado após a ruptura mecânica dos tecidos por agitação, seguida de centrifugação descontínua gradiente em Percoll. Este artigo descreve uma técnica viável e inovadora para o isolamento do intestino intestinal epiCélulas celulares. As proteínas de superfície celular biotiniladas, isoladas a partir da superfície destas células epiteliais, podem subsequentemente analisar em aplicações a jusante tais como análise de FACS e / ou LC-MS / MS.