Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em> Rhipicephalus microplus</em> Cellule epiteliali delle ghiandole

Rhipicephalus microplus , il segno del bestiame, è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sull'industria del bestiame delle regioni tropicali e subtropicali in quanto vectors bovine tick-tick (babesiosis), anaplasmosis e piroplasmosis equestre ^{1 , 2 , 3 , 4} . Gli sforzi sono stati dedicati al controllo dei bovini da bestiame, per diminuire l'effetto deleterio, tuttavia i metodi convenzionali come l'uso di acaricidi chimici hanno inconvenienti impliciti, come la presenza di residui chimici nel latte e la carne e l'aumento della prevalenza di zecche chimicamente resistenti ^{5 , 6 , 7} . Di conseguenza, è stato studiato lo sviluppo di metodi alternativi di controllo del bersaglio, come l'uso di bovini di resistenza naturale, il controllo biologico (biopesticidi) e il vaccinoInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Nel perseguimento di proteine ​​in grado di essere utilizzate come candidati per il vaccino, la ricerca attuale è incentrata sul guscio del timo. La parete midgut è costruita da un unico strato di cellule epiteliali che poggiano su una sottile lamina basale, con l'esterno della lamina basale che forma una rete muscolare. Le osservazioni del microscopio della luce e dell'elettronica indicano che il midgut è costituito da tre tipi di cellule: riserva (indifferenziata), secrezione e digestione. Il numero di tipi di cellule varia notevolmente a seconda della fase fisiologica. Le cellule di secretory e digestive sono entrambe originate dalle cellule di riserva ^{18 , 19 , 20} .

La costruzione di librerie cDNAPer esaminare la composizione dell'intestino del guscio ha portato all'identificazione di proteine ​​antigeniche, come Bm86, come candidati potenziali per la vaccinazione ^{2 , 3 , 4} . La glicoproteina Bm86 è localizzata sulla superficie delle cellule gutiche del tick e induce una risposta immunitaria protettiva contro il bestiame bovino ( R. microplus ) nei bovini vaccinati. Le IgG anti-Bm86 prodotte dall'host immunizzato vengono ingerite dal ticchettio, riconoscono questo antigene sulla superficie delle cellule intestinali, e quindi disturbano la funzionalità e l'integrità del tessuto intestinale. I vaccini basati sugli antigeni Bm86 hanno mostrato un controllo efficace di R. microplus e Rhipicephalus annulatus, riducendo il numero, il peso e la capacità riproduttiva delle femmine incurvando, con conseguente riduzione delle infestazioni di larvali nelle successive generazioni di ticchetti ⁴ . Tuttavia, i vaccini basati su Bm86 non sono efficaci contro tutte le fasi del tick e hannoHa dimostrato un'efficacia insoddisfacente nei confronti di alcuni ceppi geografici di R. microplus , di conseguenza le industrie bovine e lattiero-caseari hanno adottato male questi vaccini ^{2 , 4} .

La capacità di isolare le cellule epiteliali dall'intestino è una innovazione significativa che consentirebbe la progressione della ricerca a determinare la composizione della membrana proteica, compresa la morfologia e la fisiologia in condizioni ambientali differenti. Il metodo qui descritto utilizza l'agente chelante acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) e l'agente riducente tris (2-carbossiletil) fosfina (TCEP) per rilasciare l'epitelio dai suoi tessuti di supporto sub-epiteliali ¹⁰ . L'epitelio viene recuperato a seguito di scosse meccaniche dei tessuti agitando, seguita da centrifugazione a gradiente discontinua in Percoll. Questo articolo descrive una tecnica fattibile e novella per l'isolamento di epi di zuccheroCellule teliali. Le proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate, isolate dalla superficie di queste cellule epiteliali, possono successivamente essere analizzate in applicazioni a valle come FACS e / o analisi LC-MS / MS.