Zuivering van Biotinylated Cell Surface Proteins uit<em> Rhipicephalus microplus</em> Epitheliale darmcellen
Summary
Een gemodificeerde dichtheidscentrifugatiegradient gebaseerde methodologie werd gebruikt om epitheelcellen van Rhipicephalus microplus gutweefsel te isoleren. Oppervlakte gebonden eiwitten werden biotinyleerd en gezuiverd door streptavidine magnetische kralen voor gebruik in downstream toepassingen.
Abstract
Rhipicephalus microplus – de veestok – is de belangrijkste ectoparasiet in termen van economische impact op vee als vector van verschillende pathogenen. Er is gewerkt aan de veestokcontrole om de schadelijke effecten ervan te verminderen, met de nadruk op de ontdekking van vaccinekandidaten, zoals BM86, gelegen op het oppervlak van de epitheelcellen. Huidig onderzoek richt zich op het gebruik van cDNA en genomische bibliotheken, om te screenen voor andere vaccin kandidaten. De isolatie van tikgutcellen vormt een belangrijk voordeel bij het onderzoeken van de samenstelling van oppervlakte-eiwitten op het membraan van de tikkeldarmcellen. Dit papier vormt een nieuwe en haalbare methode voor het isoleren van epitheliale cellen, uit de tikgutinhoud van halfgegraveerde R. microplus. Dit protocol maakt gebruik van TCEP en EDTA om de epitheelcellen uit de subepitheliale ondersteunende weefsels te ontlasten en een discontinuous density centrifugatiegradieNt om epitheelcellen van andere celsoorten te scheiden. Cel-oppervlakte-eiwitten werden biotinyleerd en geïsoleerd uit de epitheelcellen van de tikgut, met behulp van streptavidine-gekoppelde magnetische kralen, die toestaan voor downstream toepassingen in FACS of LC-MS / MS-analyse.
Introduction
Rhipicephalus microplus , de veestok, is de meest significante ectoparasiet in termen van economische impact op de veeindustrie van tropische en subtropische regio's, aangezien het vectoren boviene tik koorts (babesiosis), anaplasmose en paardenpiroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 is . Er zijn inspanningen gedaan voor veestokcontrole om het schadelijke effect te verminderen, maar conventionele methoden zoals het gebruik van chemische acariciden hebben impliciete nadelen, zoals de aanwezigheid van chemische residuen in melk en vlees, en de toename van de prevalentie van chemisch resistente tegels 5 , 6 , 7 . Bijgevolg is de ontwikkeling van alternatieve methoden voor tikbesturing onderzocht, zoals het gebruik van natuurlijk resistentiebeest, biologische bestrijding (biopesticiden) en vaccinInen 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
In het nastreven van eiwitten die kunnen worden gebruikt als vaccin kandidaten, is het huidige onderzoek gericht op de tikgut. De midgutmuur is gebouwd uit een enkele laag epitheliale cellen die op een dunne basale lamina rusten, waarbij de buitenkant van de basale lamina een netwerk van spieren vormt. Licht- en elektronmicroscoopwaarnemingen wijzen erop dat de midgut bestaat uit drie typen cellen: reserve (ongedifferentieerd), secretie en spijsvertering. Het aantal celtypes varieert aanzienlijk afhankelijk van de fysiologische fase. Secretory en spijsverteringscellen zijn afkomstig van reservecellen 18 , 19 , 20 .
De constructie van cDNA bibliothekenOm de samenstelling van de tikgoot te onderzoeken heeft geleid tot de identificatie van antigeen eiwitten, zoals Bm86, als potentiële vaccin kandidaten 2 , 3 , 4 . Het glycoproteïne Bm86 is gelokaliseerd op het oppervlak van bosluiscellen en veroorzaakt een beschermende immuunrespons tegen de veekenteken ( R. microplus ) bij gevaccineerde vee. Anti-Bm86 IgG's die worden geproduceerd door de geïmmuniseerde gastheer worden ingehaald door de tik, herken dit antigeen op het oppervlak van tikgutcellen, en versteur vervolgens de tikweefselfunctie en integriteit. Vaccins op basis van Bm86 antigenen hebben effectieve controle van R. microplus en Rhipicephalus annulatus getoond , door het aantal, gewicht en voortplantingscapaciteit van ingewikkelde vrouwtjes te verminderen, wat resulteert in een verminderde larve-besmetting in daaropvolgende tikgeneraties 4 . Bm86-gebaseerde vaccins zijn echter niet effectief tegen alle tikstadia en hebbenHeeft onbevredigende effectiviteit aangetoond tegen sommige geografische stammen van R. microplus , waardoor de rundvlees- en zuivelindustrie deze vaccins 2 , 4 slecht heeft aangenomen.
Het vermogen om epitheelcellen uit de tikgut te isoleren is een belangrijke innovatie die de voortgang van het onderzoek mogelijk maakt om eiwitmembraansamenstelling te bepalen, waaronder morfologie en fysiologie onder verschillende omgevingsomstandigheden. De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van het chelaatmiddel ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) om het epithelium uit zijn subepitheelondersteunende weefsels 10 te ontlasten. Het epithelium wordt hersteld na mechanische verstoring van de weefsels door schudden, gevolgd door discontinuous gradient centrifugatie in Percoll. Dit papier beschrijft een haalbare en nieuwe techniek voor het isoleren van tikgut epiTheliale cellen. Biotinyleerde celoppervlakte-eiwitten, geïsoleerd uit het oppervlak van deze epitheliale cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in downstream toepassingen, zoals FACS en / of LC-MS / MS-analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veebesmettingen zijn een belangrijk probleem voor de veeindustrie in tropische en subtropische gebieden van de wereld, met de meest voorkomende methode van controle afhankelijk van het gebruik van acariciden 1 , 4 . Bm86 werd eerder geïdentificeerd binnen het epitheelvlak van de tikgut als beschermend antigeen tegen R. microplus infestatie 10 , met beperkt succes als een vaccinestrategie door Bm86 geografische sequentievariatie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen de Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australië) bedanken voor de levering van Rhipicephalus microplus- ticks die voor deze studie werden gebruikt, en Lucas Karbanowicz voor assistentie bij videofilms.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
