Preparación de vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea para terapia potencial de reemplazo de citoplasma
Summary
Enfermedades relacionadas con la edad se asocian con múltiples defectos en los componentes del citoplasma. Aquí, presentamos un protocolo para preparar vesículas de membrana plasmática de células madre mesenquimales de médula ósea. Esta técnica podría utilizarse potencialmente como medio de terapia de reemplazo del citoplasma para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad.
Abstract
Hemos informado anteriormente sobre la generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs) a través de la extrusión mecánica de células de mamíferos. La fusión de PMVs con células Rho0 deficientes mitocondriales restauró la actividad mitótica en condiciones normales de cultivo. La aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer son enfermedades relacionadas con la edad que se ha informado que están asociadas con múltiples defectos mecánicos y funcionales en el citosol y organelos de una variedad de tipos celulares. Las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) representan una población celular única de la médula ósea que posee capacidades de auto-renovación mientras mantiene su multipotencia. La suplementación de células de senescencia con citoplasma joven de BMSC autóloga a través de la fusión de PMVs proporciona un enfoque prometedor para mejorar o incluso revertir los fenotipos asociados a la edad. Este protocolo describe cómo preparar PMVs de BMSCs a través de la extrusión a través de una membrana de policarbonato con 3Determinan la existencia de mitocondrias y examinan el mantenimiento del potencial de membrana dentro de PMVs usando un microscopio confocal, concentran PMVs por centrifugación y llevan a cabo la inyección in vivo de PMVs en el músculo gastrocnemio de ratones.
Introduction
Se ha dedicado una tremenda cantidad de esfuerzo a establecer enfoques para terapias de reemplazo de genes, enzimas y células. Esto ha dado lugar a grandes avances e incluso aplicaciones clínicas 1 , 2 , 3 . Recientemente, una terapia de reemplazo de mitocondrias polémica basada en la tecnología de transferencia de núcleo se aplicó a la fecundación in vitro para las mujeres de edad avanzada o portador de una mutación mitocondrial letal del ADN [ 4] . Los defectos encontrados en enfermedades relacionadas con la edad, como la aterosclerosis, la diabetes tipo 2, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer, suelen ser multifacéticos. Se ha documentado que la acumulación de gotitas de lípidos; La deposición de proteína amiloide; La retención de proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico; Y proteasoma defectuoso, autofagosoma y mitocondrias contribuyen al desarrollo o agravamiento de estas enfermedades"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . En la actualidad, no existe un mecanismo disponible dirigido a la remediación directa de malfuncionamiento en el citosol y orgánulos, que causa la senescencia y los fenotipos de envejecimiento.
Hemos informado anteriormente sobre la generación de vesículas de membrana plasmática (PMVs) a través de la extrusión mecánica de células de mamíferos [ 12] . Con la excepción del núcleo, los componentes de la membrana o citosol, incluyendo proteínas y ARN, así como los organelos, como las mitocondrias, se encontraron en PMVs. Esencialmente, una PMV puede ser considerada como una célula enucleada en miniatura. Más importante aún, la fusión de PMVs con células Rho0 deficientes en mitocondrias restauró la actividad mitótica en condiciones normales de cultivo. Este es el primer informe sobreUn enfoque potencialmente eficiente para la terapia de reemplazo del citoplasma.
Las células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC) son células progenitoras multipotentes que se generan rutinariamente a partir de la médula ósea y se expanden fácilmente en cultivo. Marcadores de células madre embrionarias Oct4, Nanog, y SOX2 se han detectado a bajos niveles en MSCs [ 13] . La actividad de la telomerasa también es medible. Además, la ausencia de moléculas coestimuladoras y de moléculas de antígeno de leucocitos humanos (HLA) de clase II, así como la baja expresión de HLA de clase I en MSC, las convierten en células ideales para uso alogénico o "off-the-shelf" Tanto la medicina regenerativa como las aplicaciones inmunomoduladoras 14 .
Aquí se describe cómo preparar PMVs de BMSC de ratón mediante extrusión a través de una membrana de policarbonato con poros de 3 μm, determinar la existencia de mitocondrias y examinar el mantenimiento del potencial de membrana en PMVs utilizando confocAl microscopio, preparar concentrados pero no agregados PMV por centrifugación, y llevar a cabo la inyección in vivo de PMVs en el músculo gastrocnemius de ratones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Fundación Li Ka Shing, el Proyecto de la Universidad de Alto Nivel de Guangdong "Tecnologías Verdes para Industrias Marinas", la Fundación de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), y el Departamento de Educación de Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
