إعداد حويصلات غشاء البلازما من خلايا نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة لاحتمال استبدال السيتوبلازم العلاج
Summary
ترتبط الأمراض المرتبطة بالعمر مع عيوب متعددة في مكونات السيتوبلازم. هنا، نقدم بروتوكول لإعداد الحويصلات غشاء البلازما من الخلايا الجذعية نخاع العظم الوسيطة. ويمكن استخدام هذه التقنية كوسيلة للعلاج استبدال السيتوبلازم لتحسين أو حتى عكس الظواهر المرتبطة بالعمر.
Abstract
لقد سبق أن أبلغنا عن توليد حويصلات غشاء البلازما (بمفس) من خلال البثق الميكانيكي للخلايا الثدييات. اندماج من بمفس مع خلايا Ro0 ناقصة الميتوكوندريا استعادة النشاط الانقسامي في ظل ظروف الثقافة العادية. تصلب الشرايين، داء السكري من النوع الثاني، مرض الزهايمر، والسرطان هي الأمراض المرتبطة بالعمر التي تم الإبلاغ عنها أن ترتبط بالعديد من العيوب الميكانيكية والوظيفية في السيتوسول وعضيات مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. الخلايا الجذعية الوسيطة النخاع العظم (بمسك) تمثل خلية فريدة من السكان من نخاع العظام التي تمتلك قدرات التجديد الذاتي مع الحفاظ على تعددها. مكملات خلايا الشيخوخة مع السيتوبلازم الشباب من بمسس ذاتي عن طريق الانصهار من بمفس يوفر نهجا واعدا لتحسين أو حتى عكس الظواهر المرتبطة بالعمر. يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد بمفس من بمسك عن طريق قذف من خلال غشاء البولي مع 31؛ م المسام، وتحديد وجود الميتوكوندريا وفحص الحفاظ على إمكانات الغشاء داخل بمفس باستخدام المجهر متحد البؤر، وتركيز بمفس بواسطة الطرد المركزي، وتنفيذ الحقن في الجسم الحي من بمفس في عضلة الساق من الفئران.
Introduction
وقد كرس قدرا هائلا من الجهد لوضع نهج للعلاجات الجينات والإنزيم، واستبدال الخلايا. وقد أدى هذا إلى اختراقات كبيرة وحتى التطبيقات السريرية 1 ، 2 ، 3 . في الآونة الأخيرة، تم تطبيق العلاج البديل الميتوكوندريا المثير للجدل على أساس تكنولوجيا نقل النواة إلى الإخصاب في المختبر للنساء في سن الشيخوخة أو تحمل طفرات الحمض النووي الميتوكوندريا القاتلة 4 . العيوب الموجودة في الأمراض المرتبطة بالعمر، بما في ذلك تصلب الشرايين، داء السكري من النوع 2، مرض الزهايمر، والسرطان، وعادة ما تكون متعددة الأوجه. وقد تم توثيق أن تراكم قطرات الدهون. وترسب البروتين اميلويد. الاحتفاظ بالبروتينات تكشفت في الشبكة إندوبلازميك. و بروتاسوم معيبة، أوتوفاغوسوم، والميتوكوندريا تسهم في تطوير أو تفاقم هذه الأمراض"كريف"> 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . في الوقت الحاضر، لا توجد آلية متاحة تهدف إلى معالجة مباشرة من خلل في السيتوسول والعضيات، والذي يسبب شيخوخة والشيخوخة المظاهر.
لقد ذكرنا سابقا على توليد حويصلات غشاء البلازما (بمفس) من خلال البثق الميكانيكي للخلايا الثدييات 12 . وباستثناء النواة، تم العثور على مكونات في الغشاء أو السيتوسول، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي الريبي، وكذلك العضيات، مثل الميتوكوندريا، في بمف. أساسا، يمكن أن ينظر إلى بمف على أنه خلية مصغرة مستأصلة. الأهم من ذلك، اندماج من بمفس مع خلايا Ro0 الناقصة الميتوكوندريا استعادة النشاط الانقسامي في ظل ظروف الثقافة العادية. هذا هو أول تقرير عن إستابليشينج نهجا يحتمل أن تكون فعالة لعلاج السيتوبلازم استبدال.
نخاع العظم الخلايا الجذعية الوسيطة (بمسك) هي الخلايا السلف متعددة الأشكال التي يتم إنشاؤها بشكل روتيني من نخاع العظام ويتم توسيعها بسهولة في الثقافة. وقد تم الكشف عن علامات الخلايا الجذعية الجنينية Oct4، نانوغ، و SOX2 عند مستويات منخفضة في مسس 13 . نشاط تيلوميراز هو أيضا قابلة للقياس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم وجود جزيئات التحفيز المشترك وجزيئات مستضد الكريات البيض البشرية (هلا) من الدرجة الثانية، فضلا عن انخفاض هلا الفئة الأولى التعبير على اللجان الدائمة، وجعلها خلايا مثالية ل ألوجنيك، أو "من على الرف"، واستخدام في سواء الطب التجديدي والتطبيقات المناعية 14 .
هنا، نحن تصف كيفية إعداد بمفس من الماوس بمسس عن طريق قذف من خلال غشاء البولي مع المسام 3 ميكرون، وتحديد وجود الميتوكوندريا ودراسة الحفاظ على إمكانات الغشاء في بمفس باستخدام كونفوكالمجهر، وإعداد المركزة بمفس ولكن لا تجميعها بواسطة الطرد المركزي، وتنفيذ الحقن في الجسم الحي من بمفس في عضلة الساق من الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة لي كا شينغ، ومشروع جامعة قوانغدونغ رفيع المستوى "التكنولوجيات الخضراء للصناعات البحرية"، ومؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (http://www.nsfc.gov.cn/ منحة رقم 30971665، 81172894، 81370925)، وقسم التعليم في قوانغدونغ (http://www.gdhed.edu.cn/ منحة رقم cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
