Preparazione di vescicole a membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per potenziali terapie di sostituzione del citoplasma
Summary
Le malattie legate all'età sono associate a più difetti nei componenti del citoplasma. Qui presentiamo un protocollo per preparare vescicole a membrana plasmatica dalle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo. Questa tecnica potrebbe essere potenzialmente utilizzata come mezzo di terapia sostitutiva per citoplasma per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età.
Abstract
Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi. La fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondriali ha ripristinato l'attività mitotica in condizioni normali di coltura. L'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro sono malattie legate all'età che sono state riportate per essere associate a più difetti meccanici e funzionali nel citosolo e negli organelli di una varietà di tipi di cellule. Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) rappresentano una popolazione cellulare unica dal midollo osseo che possiede capacità di auto-rinnovamento pur mantenendo la loro multipotenza. L'integrazione di cellule di senescenza con giovane citoplasma da BMSC autologhe attraverso la fusione di PMV fornisce un approccio promettente per migliorare o addirittura invertire i fenotipi associati all'età. Questo protocollo descrive come preparare PMV da BMSC tramite estrusione attraverso una membrana policarbonato con 3Determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la conservazione del potenziale delle membrane all'interno di PMV usando un microscopio confocale, concentrare PMV mediante centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.
Introduction
Una grande quantità di sforzi è stata dedicata alla creazione di approcci per terapie di sostituzione di geni, enzimi e cellule. Ciò ha portato a grandi scoperte e persino alle applicazioni cliniche 1 , 2 , 3 . Recentemente, una controversa terapia sostitutiva di mitocondri basata sulla tecnologia di trasferimento del nucleo è stata applicata alla fecondazione in vitro per le donne di età avanzata o con una mutazione letale del DNA mitocondriale 4 . I difetti riscontrati nelle malattie legate all'età, tra cui l'aterosclerosi, il diabete di tipo 2, la malattia di Alzheimer e il cancro, sono di solito multi-faceted. È stato documentato che l'accumulo di gocce lipidiche; La deposizione di proteine amiloide; La conservazione delle proteine dispiegate nel reticolo endoplasmatico; E proteasomi difettosi, autofaggo e mitocondri contribuiscono allo sviluppo o all'aggravamento di queste malattie"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Attualmente, non esiste un meccanismo disponibile per la rimozione diretta del malfunzionamento nel citosolo e negli organi, che provoca senescenza e fenotipi di invecchiamento.
Abbiamo già riferito sulla generazione di vescicole a membrana plasmatica (PMV) attraverso l'estrusione meccanica delle cellule dei mammiferi 12 . Ad eccezione del nucleo, i componenti della membrana o del citosolo, tra cui proteine e RNA, nonché gli organelli, come i mitocondri, sono stati trovati nei PMV. In sostanza, un PMV può essere considerato come una cellula enucleata in miniatura. Ancora più importante, la fusione di PMV con cellule Rho0 carenti di mitocondri ha ripristinato l'attività mitotica in normali condizioni di coltura. Questa è la prima relazione su establiUn approccio potenzialmente efficiente per la terapia sostitutiva del citoplasma.
Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule progenitrici multipotenti generate genericamente dal midollo osseo e sono facilmente espandibili nella coltura. I marcatori delle cellule staminali embrionali Oct4, Nanog e SOX2 sono stati rilevati a bassi livelli nei MSC 13 . L'attività della telomerasi è anche misurabile. Inoltre, l'assenza di molecole coestimolanti e molecole di Classe II dell'antigene delle cellule umane (HLA), nonché la bassa espressione di HLA di classe I su MSC, li rendono le cellule ideali per l'uso allogeneico o "off-the-shelf" Sia la medicina rigenerativa che le applicazioni immunomodulatorie 14 .
Qui descriviamo come preparare PMV da BMSC del mouse attraverso l'estrusione attraverso una membrana di policarbonato con pori da 3 μm, determinare l'esistenza di mitocondri e esaminare la manutenzione del potenziale delle membrane nei PMV utilizzando confocAl microscopio, preparare PMV concentrati ma non aggregati per centrifugazione e effettuare l'iniezione in vivo di PMV nel muscolo gastrocnemico dei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Li Ka Shing, il Guangdong University High Level Project "Green Technologies for Marine Industries", la Fondazione della Scienza Naturale della Cina (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) e il Dipartimento per l'istruzione del Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
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