Bereiding van plasmamembraanvezels uit botmarges Mesenchymale stamcellen voor potentiële cytoplasmvervangende therapie
Summary
Leeftijdgerelateerde aandoeningen zijn geassocieerd met meerdere defecten in componenten van het cytoplasma. Hier presenteren we een protocol om plasmamembraan vesicles uit mesmermale stamcellen van beenmerg te bereiden. Deze techniek kan potentieel gebruikt worden als middel voor het vervangen van cytoplasma ter verbetering van de leeftijd-geassocieerde fenotypen.
Abstract
We hebben eerder gerapporteerd over de opwekking van plasmembraan vesicles (PMV's) via de mechanische extrusie van zoogdiercellen. De fusie van PMV's met mitochondriale deficiënte Rho0-cellen herstelde mitotische activiteit onder normale kweekomstandigheden. Atherosclerose, type 2 diabetes, de ziekte van Alzheimer en kanker zijn leeftijdgerelateerde aandoeningen die gerapporteerd zijn geassocieerd te zijn met meerdere mechanische en functionele defecten in de cytosol en organellen van een verscheidenheid van celtypen. Beenmerg-mesenchymale stamcellen (BMSC's) vertegenwoordigen een unieke celpopulatie uit het beenmerg dat zelfvernieuwende mogelijkheden bezit, terwijl ze hun multipotency behouden. De toevoeging van senescenscellen met jong cytoplasma van autologe BMSC's via de fusie van PMV's, biedt een veelbelovende aanpak om verouderde of zelfs omgekeerde leeftijd-geassocieerde fenotypes te verbeteren. Dit protocol beschrijft hoe u PMV's van BMSC's kunt voorbereiden via extrusie via een polycarbonaatmembraan met 31; m poriën, het bestaan van mitochondria bepalen en het behoud van membraanpotentieel binnen PMV's onderzoeken met behulp van een confocale microscoop, concentreer PMV's door centrifugeren, en voer de in vivo injectie van PMV's uit in de gastrocnemiusspier van muizen.
Introduction
Er is een enorme hoeveelheid inspanning gewijd aan het vaststellen van benaderingen voor gen-, enzym- en celvervangende therapieën. Dit heeft geleid tot grote doorbraken en zelfs klinische toepassingen 1 , 2 , 3 . Onlangs is een controversiële mitochondria vervangende therapie gebaseerd op nucleus transfer technologie toegepast op in vitro bevruchting voor vrouwen van oude leeftijd of met een dodelijke mitochondriale DNA mutatie 4 . Defecten gevonden in leeftijdgerelateerde ziekten, waaronder atherosclerose, type 2 diabetes, de ziekte van Alzheimer en kanker zijn meestal veelzijdig. Er is gedocumenteerd dat de accumulatie van lipidedruppels; De afzetting van amyloïd eiwit; Het vasthouden van ontvouwen eiwitten in het endoplasmatische reticulum; En defect proteasoom, autofagosoom en mitochondriën dragen bij tot de ontwikkeling of verergering van deze ziekten"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Momenteel is er geen beschikbaar mechanisme dat gericht is op directe remediëring van storingen in de cytosol en organellen, die senescentie en veroudering van fenotypes veroorzaakt.
We hebben eerder gemeld over de opwekking van plasmamembraanvezels (PMV's) via de mechanische extrusie van zoogdiercellen 12 . Met uitzondering van de kern werden componenten in het membraan of cytosol, inclusief eiwitten en RNA, evenals de organellen, zoals mitochondria, gevonden in PMV's. In wezen kan een PMV worden beschouwd als een miniatuur enucleated cel. Nog belangrijker, de fusie van PMV's met mitochondria-deficiënte Rho0-cellen herstelde mitotische activiteit onder normale kweekomstandigheden. Dit is het eerste rapport over establiEen potentieel efficiënte benadering voor cytoplasmavervangende therapie mogelijk maken.
Beenmerg mesenchymale stamcellen (BMSC's) zijn multipotente stamvader cellen die routinematig worden gegenereerd uit het beenmerg en worden gemakkelijk uitgebouwd in cultuur. Embryonale stamcelmarkers Oct4, Nanog en SOX2 zijn op lage niveaus in MSCs 13 gedetecteerd. Telomerase activiteit is ook meetbaar. Daarnaast maken de afwezigheid van co-stimulerende moleculen en humane leukocytenantigeen (HLA) klasse II-moleculen, evenals lage HLA klasse I-expressie op MSC's, de ideale cellen voor allogene of "off-the-shelf" gebruik in Zowel regeneratieve medicijnen als immunomodulerende toepassingen 14 .
Hier beschrijven we hoe u PMV's van muis BMSC's kunt voorbereiden via extrusie via een polycarbonaatmembraan met 3 μm poriën, bepalen het bestaan van mitochondria en controleer het onderhoud van membraanpotentiaal in PMV's met behulp van confocatieAl microscopie, bereide geconcentreerde maar niet geaggregeerde PMV's door centrifugeren, en voer de in vivo injectie van PMV's uit in de gastrocnemius spier van muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Li Ka Shing Foundation, het Guangdong High Level University Project "Green Technologies for Marine Industries", de Stichting Natuurwetenschappen van China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) en de Onderwijsafdeling van Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
