Vorbereitung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark Mesenchymale Stammzellen für potentielle Zytoplasma-Ersatztherapie
Summary
Altersbedingte Krankheiten sind mit mehreren Defekten in Komponenten des Zytoplasmas verbunden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark-Mesenchym-Stammzellen. Diese Technik könnte potentiell als Mittel zur Zytoplasma-Ersatztherapie verwendet werden, um altersbedingte Phänotypen zu lindern oder sogar umzukehren.
Abstract
Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen berichtet. Die Fusion von PMVs mit mitochondrialen defizienten Rho0-Zellen stellte die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wieder her. Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs sind altersbedingte Erkrankungen, von denen berichtet wurde, dass sie mit mehreren mechanischen und funktionellen Defekten im Cytosol und Organellen einer Vielzahl von Zelltypen assoziiert sind. Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) stellen eine einzigartige Zellpopulation aus dem Knochenmark dar, die Selbsterneuerungsfähigkeiten besitzen und gleichzeitig ihre Multipotenz beibehalten. Die Ergänzung von Seneszenzzellen mit dem jungen Zytoplasma aus autologen BMSCs über die Fusion von PMVs bietet einen vielversprechenden Ansatz, um altersbedingte Phänotypen zu verbessern oder sogar umzukehren. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von PMVs aus BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonatmembran mit 31, m Poren, bestimmen die Existenz von Mitochondrien und untersuchen die Aufrechterhaltung des Membranpotentials innerhalb von PMVs unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, konzentrieren PMVs durch Zentrifugation und führen die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durch.
Introduction
Eine enorme Menge an Aufwand wurde der Etablierung von Ansätzen für Gen-, Enzym- und Zellersatztherapien gewidmet. Dies führte zu großen Durchbrüchen und sogar klinischen Anwendungen 1 , 2 , 3 . In jüngster Zeit wurde eine umstrittene Mitochondrien-Ersatztherapie auf Basis der Nukleustransfertechnologie auf die In-vitro- Fertilisation für Frauen im Alter angewendet oder mit einer tödlichen mitochondrialen DNA-Mutation 4 assoziiert. Defekte, die bei altersbedingten Krankheiten, einschließlich Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs, gefunden werden, sind in der Regel facettenreich. Es wurde dokumentiert, dass die Ansammlung von Lipidtröpfchen; Die Ablagerung von Amyloidprotein; Die Beibehaltung von entfalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum; Und defektes Proteasom, Autophagosom und Mitochondrien tragen zur Entwicklung oder Verschlimmerung dieser Krankheiten bei"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Gegenwärtig gibt es keinen verfügbaren Mechanismus zur direkten Sanierung von Fehlfunktionen im Cytosol und Organellen, die Seneszenz und Alterung Phänotypen verursacht.
Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen 12 berichtet. Mit Ausnahme des Kerns wurden in PMVs Komponenten in der Membran oder Cytosol einschließlich Proteine und RNA sowie die Organellen wie Mitochondrien gefunden. Im Wesentlichen kann ein PMV als eine Miniatur-Enkernzelle betrachtet werden. Noch wichtiger ist, dass die Fusion von PMVs mit mitochondrien-defizienten Rho0-Zellen die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wiederherstellte. Dies ist der erste bericht auf establiEinen potenziell effizienten Ansatz für die Zytoplasma-Ersatztherapie.
Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind multipotenten Vorläuferzellen, die routinemäßig aus dem Knochenmark erzeugt werden und in Kultur leicht expandiert werden. Embryonale Stammzellmarker Oct4, Nanog und SOX2 wurden bei niedrigen Werten in MSCs 13 nachgewiesen. Telomerase-Aktivität ist auch messbar. Darüber hinaus machen die Abwesenheit von co-stimulierenden Molekülen und menschlichen Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-II-Molekülen sowie einer niedrigen HLA-Klasse-I-Expression auf MSCs ideale ideelle Zellen für die allogene oder "off-the-shelf" Sowohl regenerative Medizin als auch immunmodulatorische Anwendungen 14 .
Hier beschreiben wir, wie man PMVs aus Maus-BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonat-Membran mit 3-Poren-Poren herstellt, die Existenz von Mitochondrien bestimmt und die Aufrechterhaltung des Membranpotentials in PMVs mit confoc untersuchtAl-Mikroskopie, konzentrierte, aber nicht aggregierte PMVs durch Zentrifugation vorbereiten und die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Li Ka Shing Foundation, die Guangdong High-Level-Universität-Projekt "Green Technologies für Marine Industries", die Natural Science Foundation von China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant Nr. 30971665, 81172894, 81370925), und die Bildung Abteilung von Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
