Summary

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

Published: June 23, 2017
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Summary

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

Abstract

호중구의 이동과 주 화성은 우리 몸의 면역계에 중요합니다. 미세 유체 장치는 실시간 시각화, 화학 물질 농도 구배 생성의 정확한 제어, 시약 및 시료 소비 감소 등의 이점 때문에 호중구 이동 및 주 화성을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 최근에, 전체 혈액으로부터 직접적으로 통합되고 용이하게 작동되는 미세 유체 주 화성 분석 시스템을 개발하기위한 노력이 마이크로 유체 연구원에 의해 이루어졌다. 이 방향에서, 첫 번째 all-on-chip 방법은 작은 혈액량 샘플에서 호중구의 자기 음성 정화와 주 화성 분석을 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 방법은 25 분 내에 신속한 시료 – 결과 호중구 주 화성 시험을 허용합니다. 본 백서에서는 문제 해결 전략, limi에 대한 토론과 함께 온칩 주 화성 분석을위한 상세한 구성, 작동 및 데이터 분석 방법을 제공합니다미래 방향. 이 all-on-chip 방법을 사용하여 정의 된 chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 및 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 환자의 객담을 테스트하는 호중구 주 화성 분석의 대표 결과가 표시됩니다. 이 방법은 많은 세포 이동 관련 조사 및 임상 적용에 적용 가능합니다.

Introduction

화학 주성은 용해성 화학 물질 농도 구배로 이동하는 세포 이동 과정으로 면역 반응 1 , 2 , 3 , 조직 발달 4 및 암 전이 5를 포함한 많은 생물학적 과정에 결정적으로 관여합니다. 호중구는 가장 풍부한 백혈구 하위 집합이며 신체의 타고난 숙주 방어 기능을 가능하게하고 적응 면역 반응을 중재하는 데 중요한 역할을합니다 6 , 7 . 호중구에는 고도로 조절 된 주 화성 기계가 장착되어있어이 운동성 면역 세포가 병원체에서 유도 된 화학 유인 물질 ( 예 : fMLP)과 호스트 유래 화학 유인 물질 ( 예 : 인터루킨 -8)을 통과 할 수 있습니다. 호중구의 이동과 주 화성은 다양한 생리 학적 문제를 매개한다.염증 및 암과 같은 질병 1 , 9 . 따라서, 호중구 주 화성의 정확한 평가는 호중구 생물학 및 관련 질병 연구에 중요한 기능적 판독을 제공한다.

널리 사용되는 기존의 chemotaxis assays ( 예 : transwell assay 10 )와 비교하여 microfluidic 장치는 정확하게 제어 된 화학 구배 생성 및 소형화로 인해 세포 이동 및 화학 주성의 정량적 평가에 큰 가능성을 보여줍니다 11 , 12 , 13 . 지난 20 년 동안 다양한 생물학적 세포 유형, 특히 호중구의 화학 주성을 연구하기 위해 다양한 미세 유체 장치가 개발되었습니다. Spatiotemporally complex che에서 호중구의 이동을 특성화하는데 많은 노력이 기울여졌다. 마이크로 유체 장치 ( 14 , 15)에 구성된 미세 기울기를 나타낸다. 흥미로운 전략은 또한 microfluidic 장치를 사용하여 neutrophils에 의해 방향 결정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 생물 학적 연구 이외에도, microfluidic 장치의 응용 프로그램은 질병 평가 17 , 18 , 19 임상 샘플을 테스트하기 위해 확장되었습니다. 그러나, 많은 미세 유체 장치의 사용은 전문 연구 기관에만 국한되어 많은 양의 혈액 샘플로부터 오랫동안 호중구를 분리해야합니다. 따라서, 신속한 호중구 주 화성 분석을위한 통합 마이크로 유체 장치를 개발하는 추세가있어왔다. 20 , 21 , 22 ,ef "> 23 , 24 .

이 방향으로, 단일 음향 소자에 자기 음성 호중구 정제와 후속 화학 주성 분석을 통합 한 all-on-chip 방법이 개발되었습니다 25 . 이 올 온칩 방법은 다음과 같은 새로운 특징을 가지고 있습니다. 1) 접착 기반 세포 포착이나 세포 크기 기반 필터링을 통해 혈액으로부터 호중구를 분리하는 이전의 온칩 전략과는 달리,이 새로운 방법은 높은 chemoattractant 자극에 chemotaxis 측정뿐만 아니라 전체 혈액의 소량에서 neutrophils의 고순도, 온 – 자기 분리, 2) 세포 도킹 구조는 화학 기울기 채널에 가까운 호중구의 초기 위치를 정렬하는 데 도움이되며 단일 세포 추적없이 간단한 화학 주성 분석을 가능하게합니다. 3) 호중구 격리와 chemot의 통합axis 분석은 실험 단계 사이에 중단이 없을 ​​때 25 분 안에 빠른 시료 – 결과 주 화성 분석을 가능하게합니다.

이 백서는이 온칩 주 화성 분석의 구성, 작동 및 데이터 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 논문은 알려진 재조합 화학 주성분 및 복잡한 chemotactic 샘플을 환자에게 테스트 한 다음 호중구 화학 주 화성을 수행하기 위해 개발 된 방법을 효과적으로 사용하고 문제 해결 전략, 한계 및 향후 방향에 대한 토론을 보여줍니다.

Protocol

모든 인간 샘플 수집 프로토콜은 위니펙의 매니토바 대학 (University of Manitoba)의 공동 연구 교수 윤리위원회 (Joint-Faculty Research Ethics Board)의 승인을 받았습니다. 1. 미세 유체 장치 제작 ( 그림 1A ) 디자인 및 인쇄 투명 마스크. 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오. …

Representative Results

호중구는 미세 유체 장치에서 직접 한 방울의 전체 혈액에서 부정적으로 선택됩니다. 분리 된 호중구의 순도는 Giemsa 염색에 의해 확인되었으며, 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보였다 ( 그림 2A ) 25 . 이것은 소량의 전혈에서 고순도의 효과적인 칩 중성구 분리를 나타냅니다. 또한, 도킹 구조는 화학 구배 ( <s…

Discussion

이 논문에서는 호중구를 전혈에서 직접 분리하고 화학 주성 테스트를 단일 미세 유체 칩에 직접적으로 분리하는 상세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이 방법은 간편한 조작, 고순도 호중구의 부정적 선택, 신속한 샘플 – 결과 화학 주성 테스트, 감소 된 시약 및 샘플 소비 및 정확한 세포 이동 데이터 분석에서 유용한 기능을 제공합니다. 대략적으로, 입력 된 전체 혈액 샘플로부터의 호중구의 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 부분적으로 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 및 캐나다 보건 연구원 (CIHR)의 연구비 지원에 의해 지원됩니다. 위니펙의 빅토리아 종합 병원 (Victoria General Hospital)과 위니펙의 세븐 옥스 종합 병원의 임상 연구 및 응용 연구소 (Clinical Institute of Applied Research and Education)에 감사드립니다. Hagit Peretz-Soroka 박사에게 분석 작동 전략에 대한 도움이되는 토론에 감사드립니다. 워털루 대학교 (University of Waterloo)의 캐롤린 렌 (Carolyn Ren) 교수와 닥터 (Xiaoming, Cody) Chen 박사는 촬영 과정에서 관대 한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

Materials

Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)
Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

References

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Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

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