Bu makale, tam kandan alınan çipte nötrofil izolasyonunu ve kemotaks testini tek bir mikroakışkan yonga üzerine entegre ederek hızlı bir nötrofıl kemotaksis tahlilini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır.
Nötrofil göçü ve kemotaksis, vücudumuzun bağışıklık sistemi için kritik öneme sahiptir. Mikroakışkan cihazlar, gerçek zamanlı görselleştirme, kimyasal konsantrasyon gradyanı üretiminin hassas kontrolü ve reaktif ve numune tüketiminin azaltılması gibi avantajlarından ötürü nötrofil göçünü ve kemotaksiyi araştırmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, doğrudan doğruya kandan, mikroakışkan araştırmacılar tarafından entegre ve kolaylıkla çalıştırılan mikroakışkan kemotaks analizi sistemlerine yönelik büyüyen bir çaba gösterildi. Bu yönde, nötrofillerin manyetik negatif arıtımını ve küçük kan hacmi numunelerindeki kemotaksis tahlilini bütünleştirmek için ilk all-on-chip yöntemi geliştirildi. Bu yeni yöntem, 25 dakika içinde hızlı numune-sonuç nötrofil kemotaksisi testine izin verir. Bu yazıda, sorun giderme stratejileri üzerine bir tartışma ile bu all-on-chip chemotaxis tahlilinin detaylı inşası, işletimi ve veri analizi yöntemi sunulmaktadır.Tations ve gelecekteki yönergeler. Tanımlanmış bir kemoatraktan, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastasından alınan balgamın bu all-on-chip yöntemini kullanarak test eden nötrofil kemotaksis testinin temsilci sonuçları gösterilmiştir. Bu yöntem birçok hücre göçüyle ilgili araştırmalar ve klinik uygulamalar için geçerlidir.
Kemotaksis, çözünür kimyasal konsantrasyon gradiyentine yönlendirilmiş bir hücre migrasyon süreci, bağışıklık yanıtı 1 , 2 , 3 , doku gelişimi 4 ve kanser metastazı 5 dahil olmak üzere birçok biyolojik proseste kritik rol oynar. Nötrofiller, en bol beyaz kan hücresi altkümesidir ve vücudun doğal konakçı savunma işlevlerinin sağlanmasında, ayrıca adaptif bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde 6 , 7 önemli rol oynamaktadır. Nötrofiller, bu hareketli bağışıklık hücrelerinin hem patojenden türetilen kemoatraktanlara ( örn ., FMLP) ve hem de konaktan türetilen kemoatraktanlara ( örn ., Interlökin-8) karşı kemotaksis 8'e cevap verebilmelerini sağlayan oldukça düzenlenmiş kemotaktik makinelerle donatılmıştır. Nötrofil göçü ve kemotaksi çeşitli fizyolojik sorunlara aracılık ederVe inflamasyon ve kanserler 1 , 9 gibi hastalıklar. Böylece, nötrofil kemotaksisinin doğru olarak değerlendirilmesi nötrofil biyolojisi ve ilişkili hastalıkların çalışılması için önemli bir işlevsel okuma sağlar.
Yaygın olarak kullanılan kemotaksis tahlilleriyle ( örn., Transwell assay 10 ) karşılaştırıldığında, mikro akışkan cihazlar, hassas kontrol edilen kimyasal gradyan oluşumu ve minyatürleştirme sayesinde, hücre göçü ve kemotaksisin kantitatif değerlendirmesi için büyük bir vaat göstermektedir. 11 , 12 , 13 . Son yirmi yılda, farklı biyolojik hücre tiplerinin, özellikle de nötrofillerin kemotaksisini incelemek için çeşitli mikroakışkan cihazlar geliştirildi. Spatiyotik olarak kompleks che'de nötrofil göçü karakterize etmek için önemli çaba sarf edildi Mikroakışkan cihazlarda 14 , 15 yapılandırılmış olan mical gradyanlar. Nötrofiller tarafından mikroakışkan cihazlar 16 kullanılarak yönsel karar verme eğitimi için ilginç stratejiler geliştirildi. Biyolojik yönelimli araştırmanın yanı sıra, mikroakışkan cihazların uygulamaları hastalığın değerlendirilmesi için klinik örneklerin test edilmesi için genişletildi 17 , 18 , 19 . Bununla birlikte, birçok mikroakışkan cihazın kullanımı uzmanlaşmış araştırma laboratuvarlarıyla sınırlıdır ve büyük miktarda kan numunesinden uzun süre nötrofil izolasyonu gerektirir. Bu nedenle, hızlı bir şekilde nötrofil kemotaksis analizi için entegre mikroakışkan cihazlar geliştiren büyümekte olan bir eğilim, tam damla bir damla 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .
Bu yönde, manyetik negatif nötrofil saflaştırma ve takip eden kemotaksis analizini tek bir mikroakışkan cihaz üzerinde bütünleştiren all-on-chip metodu geliştirildi. Bu all-on-chip yöntemi aşağıdaki yeni özelliklere sahiptir: 1) nötrofilleri yapışkan tabanlı hücre yakalama veya hücre boyutuna dayanan filtreleme 20 , 22 ile kandan izole eden önceki çipli stratejilerin aksine, bu yeni yöntem, Saflık, nötrofillerin küçük hacimlerde tam kandaki manyetik ayrımının yanı sıra kemoatraktan uyarımı üzerine kemotaksis ölçümü; 2) hücre yerleştirme yapısı nötrofillerin başlangıç konumlarını kimyasal gradyan kanalına yakınlaştırmaya yardımcı olur ve tek hücre izlemesi olmaksızın basit kemotaks analizi yapılmasına izin verir; 3) nötrofil izolasyonu ve kemoterapiEksen tayini, deneysel adımlar arasında herhangi bir kesinti olmadığında, 25 dakika içinde hızlı örnek-sonuç kemotaksis analizine olanak tanır.
Bu yazı, all-on-chip chemotaxis testinin yapımı, çalışması ve veri analizi yöntemi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu makale, bilinen bir rekombinant kemoatraktan ve kompleks kemotaktik numuneleri hastalardan test ederek nötrofil kemotaksisi gerçekleştirmek için gelişmiş yöntemin etkin kullanımını ve bunu takiben sorun giderme stratejileri, sınırlamaları ve gelecekteki yönergeler üzerine bir tartışma ortaya koymaktadır.
Bu yazıda, doğrudan tek bir mikroakışkan yonga üzerinde kemotaksis testi ile tam kandan nötrofilleri doğrudan izole etmek için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem, kolay çalışması, yüksek saflıktaki nötrofillerin negatif seçimi, hızlı numuneden sonuç toplayan kemotaks testi, indirgenmiş reaktifler ve numune tüketimi ve doğru hücre göç verileri analizi için yararlı özellikler sunar. Kaba bir tahmini olarak, giren tam kan örneğindeki nötrofillerin en az% 25'i aygıtt…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma kısmen Kanada Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden (CIHR) hibeler tarafından desteklenmektedir. Winnipeg'daki Victoria Genel Hastanesi'ndeki Uygulamalı Araştırma ve Eğitim Klinik Enstitüsüne ve Winnipeg'taki Seven Oaks Genel Hastanesine, insan deneklerinden klinik örnekleri yönettikleri için teşekkür ediyoruz. Tahlil operasyon stratejileri hakkında yararlı tartışmalar için Dr. Hagit Peretz-Soroka'ya teşekkür ederiz. Çekimler sürecine cömertçe destek verdikleri için Waterloo Üniversitesi'nden Profesör Carolyn Ren ve Dr. Xiaoming (Cody) Chen'e teşekkür ediyoruz.
Device fabrication | |||
Mask aligner | ABM | N/A | |
Spinner | Solitec | 5000 | |
Hotplate | VWR | 11301-022 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Vacuum dessicator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
Digital scale | Ohaus | CS200 | |
SU-8 2000 thinner | Microchem | SU-8 2000 | |
SU-8 2025 photoresist | Microchem | SU-8 2025 | |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 developer | |
Si wafer | Silicon, Inc | LG2065 | |
isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-4 | |
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) |
Ellsworth Adhesives | 2065622 | |
Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
Cutting pad | N/A | N/A | Custom-made |
Punchers | N/A | N/A | Custom-made |
Name | Source | Catalog Number | Comments |
On-chip cell isolation and chemotaxis assay | |||
RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH3025502 | |
DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
Bovine serum albumin (BSA) |
Sigma-Aldrich | SH3057402 | |
Fibronectin | VWR | CACB356008 | |
fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
Magnetic disks | Indigo Instruments | 44202-1 | 5 mm in diameter, 1 mm thick |
FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD10S | |
Rhodamine | Sigma-Aldrich |
R4127-5G | |
Giemsa stain solution | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit |
STEMCELL Technologies Inc |
19666 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope | Nikon | Ti-U | |
Microscope environmental chamber. | InVivo Scientific | N/A | |
CCD camera | Nikon | DS-Fi1 |