Un metodo integrato per l'analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

Chemotaxis, un processo di migrazione diretta delle cellule a gradiente di concentrazione chimica solubile, è criticamente coinvolto in molti processi biologici, tra cui la risposta immunitaria ^{1 , 2 , 3} , lo sviluppo del tessuto ⁴ e la metastasi del cancro ⁵ . Neutrofili sono il più ricco sottocategoria delle cellule del sangue bianco e svolgono un ruolo cruciale nel permettere le funzioni di difesa innata dell'organismo del corpo, nonché nel mediare le risposte immunitarie adattative ^{6 , 7} . Neutrofili sono dotati di macchine chemotattiche altamente regolamentate che consentono a queste cellule immunitarie motile di rispondere sia a chemoattractants derivanti da patogeni ( ad es. FMLP) che ai chemoattractants derivanti da host ( ad esempio, interleukin-8) throughchemotaxis ⁸ . La migrazione di neutrofili e la chemiotassi mediano vari problemi fisiologiciE malattie come infiammazione e tumori ^{1 , 9} . Pertanto, la valutazione accurata della chemotaxide dei neutrofili fornisce una lettura funzionale importante per lo studio della biologia dei neutrofili e delle malattie associate.

Rispetto ai campioni di chimotaxis tradizionali ( es. Test di transwell ¹⁰ ), i dispositivi microfluidici mostrano grande promessa per la valutazione quantitativa della migrazione cellulare e della chemiotassi a causa della generazione chimica precisa e della miniaturizzazione dei gradienti ^{11 , 12 e 13} . Negli ultimi due decenni o giù di lì, sono stati sviluppati diversi dispositivi microfluidici per studiare la chemotaxia di diversi tipi di cellule biologiche, in particolare neutrofili ¹¹ . Uno sforzo significativo è stato dedicato a caratterizzare la migrazione di neutrofili in un complesso spatiotemporalmente complesso Gradienti micali configurati nei dispositivi microfluidici ^{14 , 15} . Sono state sviluppate anche strategie interessanti per studiare decisioni direzionali da parte dei neutrofili usando i dispositivi microfluidici ^16. All'interno della ricerca biologica, le applicazioni dei dispositivi microfluidici sono state estese per testare campioni clinici per la valutazione delle malattie ^{17 , 18 e 19} . Tuttavia, l'uso di molti dispositivi microfluidici è limitato a laboratori di ricerca specializzati e richiede un lungo isolamento dei neutrofili da un ampio volume di campioni di sangue. Pertanto, vi è stato un trend crescente di sviluppo di dispositivi microfluidici integrati per l'analisi rapida della chimotassi neutrofila direttamente da una goccia di sangue intero ^{20 , 21 , 22 ,}Ef "> 23 ^{, 24} .

Verso questa direzione, è stato sviluppato un metodo integrale che integra la depurazione neutrofila negativa magnetica e il successivo dosaggio della chemotaxis su un unico dispositivo microfluidico ²⁵ . Questo metodo a tutto vantaggio del chip ha le seguenti caratteristiche: 1) in contrasto con le strategie precedenti su chip che isolano neutrofili dal sangue mediante bloccaggio delle cellule adesione o filtri basati sulla dimensione cellulare ^{20 , 22} , questo nuovo metodo consente elevati La purezza, la separazione magnetica su chip dei neutrofili da piccoli volumi di sangue intero, nonché la misurazione della chemotaxia sulla stimolazione del chemoattractant; 2) la struttura di ancoraggio delle cellule aiuta a allineare le posizioni iniziali dei neutrofili vicino al canale di gradiente chimico e consente un'analisi semplice di chemiotassi senza tracciamento di singole celle; 3) l'integrazione dell'isolamento neutrofilo e del chemotL'analisi dell'asse su un unico dispositivo microfluidico consente un'analisi rapida del chimotassi da campione a risultato in 25 minuti quando non vi è interruzione tra i passaggi sperimentali.

Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione, l'operazione e il metodo di analisi dei dati di questo test di chimotassi su tutti i chip. La carta dimostra l'efficace utilizzo del metodo sviluppato per l'esecuzione della chemotaxide dei neutrofili mediante la sperimentazione di un esperto chemoattractant ricombinante e campioni chemotattici complessi dai pazienti, seguito da una discussione sulle strategie di risoluzione dei problemi, le limitazioni e le direzioni future.